通常,研究人员是通过其他人的培训或技术手册的描述来掌握RNA提取及分析方法的,因此他们通常不会对实验流程提出疑问,并且会很快将其作为教条来执行。此外,也很难找到记录有导师和技术手册中所教授的“事实”的文献。关于实验室传闻,其中有一条是使用DEPC进行处理可以使溶液不含RNase。在Ambion,我们对一些传闻的DEPC处理方法进行了系统性研究,并得到了下文所述结果。后续我们还将继续推出其他技术说明,讲述Ambion测试所发现的其他RNA“真相”。

1. 高压灭菌不能有效去除溶液中的RNase,因为RNase会在溶液冷却后复性。

错误,因为单独进行高压灭菌确实可以使大量RNase A失活(图1)。将不同浓度的RNase A加入到PBS溶液中并进行高压灭菌。之后对每种溶液取用一份与304个碱基的32P标记的RNA探针进行混合并在37°C下孵育1小时,然后进行凝胶电泳并曝光拍摄。不经高压灭菌处理时,RNase浓度为100 pg/ml时探针开始降解。而高压灭菌并不能使高至1 ug/ml的RNase A完全失活,探针在其中严重降解。需注意,高压灭菌只能使部分RNase失活,不然RNA探针在任意RNase浓度下都会保持完整。单独进行高压灭菌对于部分应用来说已经足以去除足够的RNase了。但是,因为通常我们不清楚实验对什么样的RNase污染程度或浓度敏感,所以应当使用DEPC作为额外的预防措施。另外还需注意,这些实验仅针对RNase A进行了分析,对其他RNase可能不一定准确。

图1、高压灭菌对RNase活性的影响。将不同浓度的RNase A加入到PBS缓冲液中并高压灭菌25分钟。每组溶液取1 µl并与1 ng的5 x 104 cpm RNA探针(探针长度为304个碱基)进行混合并在37°C下孵育1小时。对反应体系取5 µl并用5%的丙烯酰胺/8 M尿素凝胶进行分析,然后使用增光屏曝光摄影5小时。

2. 高压灭菌会使DEPC失活

正确。高压灭菌会使二乙基焦磷酸盐水解,从而使DEPC失活,并且期间会释放出反应副产物CO2和乙醇。DEPC在水中的半衰期大约为30分钟,而对于DEPC浓度为0.1%的溶液,进行15分钟/升的高压灭菌后即可认为其不含DEPC。

3.对含DEPC的溶液进行高压灭菌应当足够久以彻底去除溶液的气味。

错误。高压灭菌后会残留轻微的乙醇气味,不过更常闻到的是一种甜水果味,这是由副产物乙醇与微量的羧酸残留结合并形成挥发性酯类而造成的。这种气味并不意味着溶液中仍有DEPC残留。

4.含Tris的溶液不能使用DEPC进行处理

正确。Tris含有氨基,从而会“吸干”DEPC,使其不能失活RNase(图2)。分别制备1 M的Tris、MOPS、HEPES和PBS缓冲液,并向每种缓冲液中分别添加0.1%或1%的DEPC。然后向每种溶液中同时加入1 µg/ml的RNase A。对所有缓冲液进行高压灭菌并分别取一份与304碱基长度的32P标记RNA探针混合然后在37°C下孵育1小时。然后使用凝胶电泳及曝光摄影来评估探针完整性。Tris和HEPES确实会使DEPC在0.1%的浓度(大多数实验方案建议浓度)下无法失活RNase。不过,1%的DEPC则足以克服这一影响。当使用DEPC处理1 M的MOPS和PBS缓冲液时,两种浓度(0.1%和1%)下的DEPC仍都可以失活RNase。要预测DEPC与所有分子生物试剂间的交互作用是不可能的。制备无RNase溶液的最谨慎方案应当为将分子生物级的粉末状试剂与DEPC处理水进行混合。或者,还可以从Ambion和其他公司购买预制的无核酸酶溶液。

图2、DEPC处理对多种缓冲液的影响。向分别含有0.1%或1%的DEPC缓冲液中加入1 µg/ml的RNase A。对溶液用力振荡1分钟,室温下孵育1小时,然后高压灭菌25分钟。对每种缓冲液取1 µl与1 ng 的5 x 104 cpm 304 nt RNA探针混合然后在37°C下孵育1小时。对反应体系取5 µl并用5%的丙烯酰胺/8 M尿素凝胶进行分析,然后使用增光屏曝光过夜后摄影。

5. 0.1%的DEPC足以抑制溶液中任意量的RNase

错误,失活RNase所需的DEPC量会随着溶液中所含的RNase残留量的增长而增长(图3)。分别将100、500和1000 ng/ml的RNase A加入到水中然后使用不同量DEPC进行处理。对溶液进行高压灭菌,然后分别取一份与304碱基长度的32P标记RNA探针混合然后在37°C下孵育1小时。然后进行凝胶电泳和曝光摄影。未处理的溶液或经0.01%DEPC处理的溶液可以使100 ng/ml RNase A失活。当RNase浓度增加为500 ng/ml时,该DEPC浓度已不足以使RNase失活,探针会发生降解。将DEPC浓度提高至0.1%时,可以保护探针免受高至500 ng/ml RNase A的影响,而1%的DEPC则可以使1000 ng/ml RNase A失活。0.1%的DEPC可能对于大多数来源于周围环境或实验操作(例如使用了大量RNase的核糖核酸酶保护实验及质粒制备等)的RNase污染来说都是足够的。

图3、不同百分比DEPC对浓度逐渐增加的RNase的影响。向一份水中加入不同浓度的RNase A,用力振荡1分钟,室温下孵育1小时,然后高压灭菌25分钟。每种溶液分别取1 µl并与1 ng 的5 x 104 cpm 304 nt RNA探针混合然后在37°C下孵育1小时。对反应体系取5 µl并用5%的丙烯酰胺/8 M尿素凝胶进行分析,然后使用增光屏曝光过夜后摄影。

6、若0.1% DEPC可以很好地抑制RNase,则1%浓度应当取得更好的效果

正确,提高DEPC浓度可以抑制更严重的RNase A污染(图3)。不过,溶液中DEPC残留或DEPC副产物的高水平残留会抑制很多酶促反应或化学修饰(羧甲基化)RNA。已有文献记载了RNA样品中残留的DEPC副产物会抑制体外翻译反应的情况(Winkler,未发表结果)。在本研究中,我们测试了转录反应中DEPC的抑制作用。使用真空离心机将模板DNA进行完全干燥,然后分别使用0.01%、0.1%和1%的DEPC处理水进行重悬。使用32P-UTP,然后添加相同浓度的DEPC水达到终体积,从而进行MAXIscript™的平行双样转录反应。对反应体系进行孵育并通过TCA沉淀来评估结合百分比。平均结合百分比如下:

反应中DEPC百分比浓度 结合百分比
0.01 64
0.10 59
1.00 53




上述数据表明,随着DEPC量的增加,转录抑制效果会越严重。再次强调,0.1%的DEPC大概就足以抑制大多数RNase,并且对实验反应带来的影响最低。若怀疑DEPC抑制了反应,可使用高质量 (MilliQÌ) 或高压灭菌水来替代加入反应中。可以使用Ambion的RNaseAlert™ Kit或参见Ambion的技术公告#166《核酸酶及蛋白酶测试:实验需求及经济角度考量》对实验用水进行检测,其中描述了与本研究所用相似的RNase测试方案。