利用LiCl沉淀纯化RNA

LiCl常用于沉淀RNA,乙醇和单价阳离子 (如钠或铵离子) 沉淀则使用更普遍。 LiCl沉淀较其他RNA沉淀方法具有较大的优势,其沉淀DNA、蛋白质或碳水化合物的效率更高 (Barlow et al., 1963)。 采用该方法可以去除RNA沉淀中的翻译或cDNA合成抑制剂 (Cathala et al., 1983).。 它还提供了一种简单快速地回收体外转录反应中的RNA的方法。

Ambion在其MEGAscript®和mMESSAGE mMACHINE®大规模体外转录试剂盒中采用LiCl作为RNA回收试剂。 但我们通过提供电话技术服务,发现许多用户不愿意使用LiCl,很可能是由于没有描述其特性的文献数据。 我们对LiCl的使用进行了系统性研究,发现它是一种极为高效的RNA沉淀方法,特别是从体外转录反应中沉淀RNA。

我们研究的三个主要变量是: (a) 沉淀形成的温度 (b) RNA和氯化锂的浓度 (c) 收集沉淀RNA的离心时间和速度。 下面探讨了上述所有变量。 我们发现采用LiCl沉淀的RNA样本,无需进一步纯化,即可用于杂交和体外翻译反应。 据报道,由于氯离子的抑制作用,氯化锂不适用于无细胞翻译 (Maniatis, et al., 1989);但我们尚不能确定其在翻译或显微注射实验中存在任何有害作用。 其他优点在于锂沉淀可以有效去除未结合的NTP,从而提高了紫外分光光度计定量的准确性。

实验步骤

采用MEGAscript体外转录试剂盒合成长度为100、300和500碱基的未标记RNA转录物。采用氯化锂沉淀RNA后重悬于水中。 采用分光光度计测定各RNA的浓度。 在50 µCi的α-[[2]32 P] UTP (800 Ci/mmol) 存在的条件下,合成另一组标记转录物,生成活性为3.3 x 10 6 cpm/µg的三条RNA转录物。

氯化锂与乙酸铵/乙醇的比较

在初步实验中,我们比较了2.5 M氯化锂和0.5 M乙酸铵及2.5体积的乙醇,沉淀长度为100和300碱基的RNA转录物的效率。 氯化锂的平均回收率为74%,乙醇为85%。 沉淀产物的凝胶分析显示氯化锂对最小的RNA片段的沉淀效率不及乙醇。 利用氯化锂制备用于核糖核酸酶保护分析的标记探针亦具有优势,对氯化锂沉淀获得的产物进行凝胶分析的条带更清晰,特别是采用非凝胶纯化的探针时。

氯化锂RNA浓度的沉淀参数

采用恒定浓度的2.5 M LiCl沉淀RNA,不断减少各种大小的RNA的量,测定特定大小和浓度的RNA是否有沉淀阈值。 将三种非放射RNA与示踪剂标记的RNA (5 x 104 cpm) 混合,分装于试管内。 先后加入水和氯化锂至终体积50 µl,氯化锂的恒定浓度为2.5 M。 分别检测各种大小的转录本,观察大小对沉淀效率的影响。 将所有样本置于-20°C下冷却30分钟,随后在4°C下以16,000 x g离心15分钟。 吸出去除上清液并干燥10分钟。 将沉淀重悬于10 µl的凝胶上样缓冲液中 (80%甲酰胺、0.1%溴酚蓝、0.1%二甲苯蓝和1 mM EDTA),95°C下加热5分钟。 取每种样本各一部分,在4% PAGE-尿素凝胶上电泳。 干燥凝胶并直接进行胶片曝光30分钟。 图1显示了RNA浓度对采用氯化锂沉淀100碱基转录物的影响。 结果显示氯化锂可有效沉淀稀释至5 µg/ml的100个核苷酸的RNA。 这个结果出人意料,因为一般认为只有高浓度的RNA方可采用氯化锂沉淀。

图1. RNA浓度对氯化锂沉淀的影响。 泳道1:RNA分子量标准。 泳道2:5 µg/ml RNA,泳道3:50 µg/ml RNA,泳道4:500 µg/ml RNA。

氯化锂浓度

采用三种不同大小的转录物检测氯化锂浓度对沉淀效率的影响。 各种大小的转录物保持恒定浓度1 µg/ml,氯化锂的检测浓度为2.5、1.0和0.5摩尔。 此外,加入标记的RNA (5 x 104 cpm) 作为示踪剂。 样本置于4°C下离心10分钟后吸干。 将沉淀重悬于10 µl的凝胶上样缓冲液中,95°C下加热10分钟,取每种样本各一部分在4% PAGE-尿素凝胶上电泳。 干燥凝胶并曝光30分钟 (不采用增光屏)。 图2显示了氯化锂对300碱基转录物沉淀的影响。 结果显示0.5摩尔浓度的氯化锂可有效沉淀RNA,所有浓度氯化锂的回收率相当。 泳道5为无氯化锂对照,用于分析离心的影响。

图2. 氯化锂浓度对RNA沉淀的影响。 泳道1:RNA分子量标准。 泳道2:2.5 M LiCl。 泳道3:1.0 M LiCl。 泳道4:0.5 M LiCl;泳道5:无LiCl。

冷却时间

RNA保持1 µg/ml的恒定浓度,氯化锂浓度为1.0 M。 检测的沉淀时间为0、0.5和1.0小时。 0.5和1.0小时的时间点采用-20°C和25°C孵育,分别检测沉淀时间和温度。 按前述方法制备样本,并在4% PAGE-尿素凝胶上显示。 图3显示,沉淀时间为30分钟时的沉淀效率高于立即离心;如泳道2与泳道3所示。 尽管-20°C和25°C下沉淀30或60分钟无差别 (如泳道3-6所示),但我们建议可以在-20°C下沉淀30分钟,降低可能存在的RNA酶的活性。

图3. 氯化锂沉淀温度的影响。 泳道1:RNA分子量标准。 泳道2:不冷却立即离心的RNA。 泳道3:离心前置于-20°C下冷却30分钟的RNA。 泳道4:采用25°C下孵育30分钟的RNA检测沉淀时间。 泳道5:20°C下冷却1小时的RNA。 泳道6:25°C下孵育1小时的RNA。

离心时间

样本中RNA恒定浓度为1 µg/ml,体积为50 µl,氯化锂浓度为1.0 M,4°C下以16,000 x g离心0.5、1、2、5、10和20分钟。 分别检测含有放射性RNA的不同大小的转录物。 图4显示离心时间是影响RNA回收的主要因素。 4°C下以16,000 x g离心20分钟,定量回收50 ng的RNA。 泳道2-7显示离心时间越短,回收率越低。

图4. 离心时间对RNA沉淀的影响。 泳道1:RNA分子量标准。 泳道2:离心20分钟的RNA;泳道3:10分钟;泳道4:5分钟;泳道5:2分钟;泳道6:1分钟;泳道7:30秒。

讨论

采用氯化锂沉淀RNA是一种快速方便地从体外转录翻译中提取转录物的方法,其未结合的核苷酸残留量极低。 氯化锂的一个主要优点是它不会有效地沉淀蛋白质或DNA。 在某些应用领域 (如核糖核酸酶保护分析),无需凝胶沉淀。 在体外或体内翻译中,采用氯化锂方法优于乙醇沉淀法,因为氯化锂通常优先回收全长转录物。 此外,由于氯化锂可以有效去除游离核苷酸,因此采用此方法沉淀的RNA进行紫外分光光度法定量时,可以获得更准确的数据。 类似的方法是采用异丙醇替代乙醇进行核酸沉淀。 异丙醇的核苷酸沉淀效率低于乙醇,当采用紫外分光光度法定量RNA浓度时,可以获得更准确的数值。

与此前公布的报道不同,我们发现氯化锂不会优先沉淀更高分子量的RNA。 采用长度为100、200、300、400和500碱基的同等量的RNA混合物 (RNA Century™分子量标准) 进行氯化锂沉淀,显示所有大小的RNA的沉淀效果均很好 (数据未显示)。 一般认为大分子量转录物有助于小分子量转录物的沉淀,本文的实验分别采用了各种大小的转录物。 单个大小的RNA (如100碱基) 与各种大小的RNA分子量标准的混合物沉淀未见差异。 但值得注意的是,氯化锂无法有效沉淀一些小RNA (如tRNA)。 这可能是由于tRNA高度复杂的二级结构造成的。 我们推荐使用氯化锂沉淀含有至少400 µg/ml RNA的溶液中的RNA,我们尚未检测其在更宽的RNA范围中的使用,因此不推荐将其用于较低浓度的RNA。

参考文献

  • Barlow, J.J., Mathias, A.P., Williamson, R., and Gammack, D.B., (1963). 适用于未降解的高分子量核糖核酸的一种简单的定量提取方法。 Biochem. Biophys. Res. Commun. 13:61-66.
  • Cathala, G., Savouret, J., Mendez, B., West, B.L., Karin, M., Martial, J.A., and Baxter, J.D., (1983). 一种提取完整且具有翻译活性的核糖核酸的方法。 DNA 2:329-335.
  • Maniatis, Sambrook, Fritsch, (1989). 分子克隆: 实验室手册第2版,第3卷,附录E.12。