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每个基因设计并测试两到四条siRNA序列

为了找到一个潜在的靶点,分析感兴趣基因的全长寻找氨基酸序列。 记录氨基酸和3′ 19核苷酸作为潜在的siRNA靶点。 潜在的靶点随后通过对GenBank数据库的BLAST分析进行评估,去掉任何与其他基因有显著同源性的靶序列。 如果可能的话,应该针对含有更少二级结构的靶mRNA区域设计siRNA。

 

选择GC含量低的siRNA

Ambion公司的研究人员发现G/ C含量 40–55%的siRNA活性比G/ C含量高于55%的高。

 

纯化体外转录的siRNA

确保所有用于转染的siRNA大小和纯度。 为了实现最高级别的纯度,我们建议使用玻璃纤维过滤器结合和洗脱,或用凝胶纯化。所用的凝胶为15- 20%的丙烯酰胺凝胶,以除去反应体系中多余的核苷酸、短低聚物、蛋白质和盐。 注意: 化学合成的RNA通常需要通过凝胶电泳进行纯化。

 

谨防RNA酶!

痕量的核糖核酸酶便可以破坏siRNA实验。 因为RNA酶存在于整个实验室环境下,包括你的皮肤、任何裸手碰过的物品或者任何在空气中暴露过的物品,所以采取措施防止和消除RNA酶污染非常重要。 Ambion针对RNA酶的检测和去除提供了全套系列的产品。

 

保持健康的细胞培养和严格的操作方案,以获得良好的转染可重复性。

一般来说,健康细胞的转染效率高于生长状态不佳的细胞。 常规的低传代次数的传代培养细胞,可最大限度降低连续细胞系从一个试验到下一个试验过程中的不稳定性。 进行优化实验时,我们建议转染50代以内的细胞。 50代以后的细胞不建议采用,因为转染效率会随时间的推移而下降。

 

避免使用抗生素

Ambion建议,从铺盘直到转染后72小时内,应避免使用抗生素。 在透化的细胞中,已经显示出抗生素积累到了毒性水平。 为获得最佳的siRNA输送效果,某些细胞和转染试剂需要无血清的条件。 我们建议在正常的生长培养基和无血清培养基中均做转染试验,以确定每个转染实验的最佳条件。

 

使用优化的试剂转染siRNA

请使用您的细胞类型适用的最佳siRNA转染试剂和试验方案。 对于siRNA试验,转染试剂的选择对于试验成功与否至关重要。 最关键的是,应使用专门配制、输送小分子RNA的转染试剂(大部分市售的转染试剂设计用于大型质粒DNA,而不是小RNA分子)。 此外,仅有部分试剂设计用于特定细胞系的转染,而多数试剂的特异性范围较广。 Lipofectamine RNAiMAX is specifically designed to transfect siRNAs with superior efficiency into eukaryotic cells.

 

使用一个适当的阳性对照来优化转染和检测条件

对于大部分细胞,管家基因适合作为阳性对照。 向靶标细胞转染几个浓度的、对您所选择的阳性对照特异的siRNA。 (这也适用于您的试验靶标siRNA。) 转染48小时后,测量对照蛋白或mRNA水平相对于未转染细胞的减少量。 太多的siRNA能导致细胞毒性和死亡。 Ambion提供适用于各种靶标基因的阳性对照siRNA

 

使用阴性对照siRNA来区分非特异性效应

通过打乱最活跃的siRNA碱基序列排列,可以设计一个适当的阴性对照。 一定要做好同源性搜索,以确保它与正在研究的生物体基因组缺乏同源性。
 

使用标记的siRNA来进行试验方案优化

荧光标记的siRNA可用于分析siRNA的稳定性和转染效率。 标记的siRNA也可用于研究siRNA的亚细胞定位,并可在双标记实验中(使用标记的抗体),追踪转染过程中转入siRNA的细胞以及转染关联的靶标蛋白下调。

仅供研究使用。 不得用于人类或动物的治疗或诊断用途。
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