1. 进行实验时要保持一致
  2. 转染时选择恰当的顺序
  3. 选用最佳密度的健康细胞
  4. 选择恰当的培养基和培养条件
  5. 选用高质量siRNA,使用最低有效浓度
  6. 使用siRNA阳性和阴性对照以及未处理的样品来监测每次实验的siRNA递送。
  7. 优化转染试剂选择和剂量
  8. 优化转染试剂/siRNA复合物接触时间
  9. 如有可能,监测mRNA和蛋白的抑制
  10. 在恰当的缓冲条件下,优化电转化电压、脉冲宽度和脉冲次数

以下的所有建议适用于siRNA,确切地说,同样可用于递送siRNA模拟物/抑制剂。

 

进行实验时要保持一致

条件优化后,应注意确保操作中每一步的顺序、时间和方式一致。 整个实验中变动因素越少,实验结果的可重复性及可靠性越高。

 

转染时选择恰当的顺序

标准的转染操作中,须在转染前约24小时细胞铺板。 反向转染操作中,细胞铺板和转染可同时进行,操作上节省了一整天的时间。 Ambion公司的科学家发现,在高效的反向转染操作中(例如使用RNAiMax):某些细胞系转染效率稍高;siRNA的浓度通常会有所降低(这可能会降低脱靶效应);更广泛浓度范围内的细胞都可成功使用。

 

选用最佳密度的健康细胞

细胞的汇合度应为40–80%,并且传代次数较低(比如小于50次),即细胞不可太老。 随着时间的推移,相对于较早传代的细胞,培养细胞的表型和生长特性通常会呈多样变化,这也会体现在表达谱中。 在培养条件影响下(例如频繁的温度和pH值变化、过度培养时培养基中的营养不足、继代培养时细胞密度太低、胰蛋白酶连续处理、激烈吹打或离心时的剪切力以及支原体污染),许多细胞的表达谱会发生改变。 每孔的细胞太少或太多,也会影响转染效率。 根据转染容器的表面积,尝试不同的细胞密度,比如设置低、中、高密度的孔。

 

选择恰当的培养基和培养条件

使用最佳的组织培养操作方法。 siRNA递送过程中,抗生素不是必需的,细胞吸收抗生素后可能会增加毒性。 此外,一些siRNA转染试剂要求在无血清或低血清的培养基中转染,所以一定要注意厂商的建议。 选择恰当的细胞培养基(例如某些细胞需要更多的葡萄糖或氨基酸)。

 

选用高质量siRNA,使用最低有效浓度

siRNA中应不含从合成过程带来的试剂(例如乙醇或盐)。 长于30bp的双链RNA污染物可通过激活非特异性的干扰素反应,产生细胞毒性,从而改变基因的表达。 Ambion公司标准纯度的siRNA没有此类污染物,非常适合细胞培养实验。 在优化递送条件的实验中,确定选用的方法和细胞类型所需siRNA的最低有效浓度,过量使用siRNA会增加非特异性(脱靶)效应。

 

使用siRNA阳性和阴性对照以及未处理的样品来监测每次实验的siRNA递送。

每次实验必须包含siRNA阴性和阳性对照,以便监测siRNA的递送效率(即比较siRNA阳性对照处理的和siRNA阴性对照处理的细胞靶标基因的表达水平)。 在多数经验证的siRNA调控和细胞体系中,可看到mRNA调控靶标抑制效率高于≥70%。 此外,应通过比较siRNA阴性对照和未处理的样品中培养的细胞活性来监测siRNA递送过程的细胞毒性。

 

优化转染试剂选择和剂量

不同细胞系和细胞类型的转染难度差别很大。 RNAiMax转染试剂能够有效地将小RNA递送到各种细胞中,而且细胞毒性非常小。 对于难转染的细胞系(如悬浮细胞、血液细胞、原代细胞和神经细胞),Ambion公司的科学家们建议在不同的浓度下至少尝试2种不同的转染试剂。 转染试剂剂量不足会影响siRNA递送和基因沉默效果,过多则会有细胞毒性。 根据不同的细胞类型,需要不同数量的转染试剂。 如果转染结果不成功(基因抑制和/或细胞活性差),可考虑采用电转化方法(参见#10)或病毒载体来递送siRNA。

 

优化转染试剂/siRNA复合物接触时间: siRNA Complexes

转染效率受转染试剂/siRNA复合物的剂量影响。 如果细胞毒性和靶基因抑制效率都很高,转染8–24小时后,可利用正常培养基更换含有转染试剂/siRNA复合物的培养基,从而降低细胞毒性并保持高的基因沉默效应。

 

如有可能,监测mRNA和蛋白的抑制

测量mRNA抑制效果,是监测siRNA处理效果的最直接的方法。 通常在转染24 - 48小时后,对靶mRNA水平进行定量。 某些情况下,也需要测量蛋白的抑制效果,从而了解siRNA处理产生的生物效应——在siRNA递送48–72]小时后测量。 蛋白表达减少问题受mRNA和蛋白质周转率的影响;对于不同的靶标基因,观察蛋白最大抑制效果的最佳时间存在差异。

 

在恰当的缓冲条件下,优化电转化电压、脉冲宽度和脉冲次数

对于“普通的”阳离子脂质体试剂难以转染的细胞系,电转化方法可能是唯一的选择。 通过方波型电脉冲能诱导细胞膜的瞬时通透性,其中电压、脉冲宽度和脉冲次数都是重要的影响因素。 与转染过程类似,在电转化条件变化时,靶基因的抑制效果和细胞死亡率之间也存在一种平衡关系。

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