引物及/或探针的解链温度(Tm)对于实时荧光定量PCR反应来说不是最佳的。

每条PCR引物的解链温度(Tm)应该在58–60°C范围内,而TaqMan探针的Tm应该比引物的高大约10°C。另外,两条引物的Tm差应该在1°C范围内。请一定注意小沟结合物(MGB)会使探针Tm升高几度,所以TAMRA™淬灭的探针与MGB-NFQ淬灭探针的序列并不是完全可互换的。(参见# 4)

 

引物及/或探针的浓度不正确

重新将引物和探针配制至正确的储存液浓度。可以通过测量260nm吸收值来确保重悬引物/探针的浓度正确。另外还应当考虑在建立实时荧光定量PCR 实验时,需要从引物和探针的储存液移液的体积(我们推荐至少≥5 µL)。引物的储存液浓度通常范围为10–100 µM而探针则为2–10 µM。将引物的质量浓度正确地换算为摩尔浓度对于重新配制是必须的[1]。例如:10,000 pmol + 100 µL H20 = 100 µM的储存液

 

引物及探针是针对低复杂度序列而设计的。

在设计独特的引物及探针序列时,低复杂度序列区域可能带来一些问题[2,3]。最好选择另外一段区域。若不可行,则可以选择使用具有更高Tm值的更长的引物和探针序列,以提高特异性。另外,对热循环方案进行优化可能也有助于减少非特异性结合。

 

探针设计为MGB,但订购时为TAMRA,或者正好相反。

有必要核实在实时荧光定量PCR 实验中使用了正确的探针(序列,报告基团及淬光基团)。若使用了错误的探针,则实时荧光定量实验中所用的探针Tm值可能是不正确的。这会显著影响PCR效率,而且对热循环进行优化也很难改进反应结果。

 

引物或探针是针对低完整度序列而设计的。

有时模板序列会存在差异/误差,从而造成引物/探针与模板不能完全匹配而导致实验失败。对序列进行核实并检查是否存在单核苷酸多态性(SNP)位点是很重要的。建议进行多重测序来避免序列信息含糊不清,同时参考包含准确序列的公共数据库,如NCBI(生物技术信息国家中心)和dbSNP(单核苷酸多态性数据库)等,以确保序列质量[3]。增加引物长度而不提高退火温度可能导致更多的引物-模板错配。

 

扩增子太长

扩增子过长可能导致较低的扩增效率。理想状况中,扩增长度应该在50到150个碱基以获得最优的PCR效率。如果需要使用较长的扩增子,则需要对热循环方案和反应组分进行优化。

 

引物及/或探针是针对基因错误区域而设计的。

设计引物及探针时应确保使用的是正确的目标序列,尤其当存在有剪接体、突变基因或目标基因属于一个大的基因家族时。有时引物/探针可能会跨越错误的剪接位点或者可能并不是针对基因家族中正确的转录本而设计的。若检测的目标正是基因突变,则理想状况下探针应该根据突变中间的序列来进行设计。引物或扩增子序列可以根据公共数据库来进行BLAST,以确保对正确序列进行扩增。

 

引物及/或探针是针对错误物种而设计的。

若您在针对混合样本(例如转基因样本、细菌群或病毒群等)中的目标序列设计引物和探针,在开始搜索引物和探针之前,请通过BLAST搜索来检查您的目标序列是否存在可能的来自其他物种的同源序列。互联网上有公共BLAST服务器可供您使用(例如www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。BLAST程序会将一段查询序列与特定数据库中的所有序列进行对比。为了获得特异性的引物和探针,您应当仅使用与其他序列具有最小相似度的目标区域来进行设计。

 

对靶标的检测不是转录本特异性的,同样会扩增背景基因组DNA。

基因组DNA(gDNA)通常都会与RNA一同被提取出来,从而在如PCR等下游应用中也可以作为模板。对污染gDNA的扩增可能会产生假阳性结果。因此,最好让引物/探针跨过靶标mRNA中的外显子间连接位点(内含子拼接位点)以防止从污染gDNA中扩增目标片段。而对于非内源序列(如来自细菌、病毒、某些植物及线粒体的序列),这些设计标准无法使用,此时比较明智的方法是使用优良的RNA提取技术来最小化背景gDNA的影响,并且可以在反转录步骤前用DNase对RNA样品进行处理。

 

订购的探针使用了所用实时荧光定量PCR仪器没有校准或不支持的染料。

确认选择了合适的染料对探针进行标记,并且核实实时荧光定量PCR仪器可以校准并支持该染料的使用。在仪器上使用该染料前可能需要进行校准。

参考文献

  1. Reconstituting and Diluting Primers and TaqMan Probes (PDF)
  2. Bioinformatic Evaluation of a Sequence for Custom TaqMan Gene Expression Assays (PDF)
  3. Wootton JC, Federhen S (1996) Analysis of compositionally biased regions in sequence databases, Methods Enzymol 266:554–571.

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仅限研究用途,不可用于任何人或动物的治疗或诊断。