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让我们助您优化试验,获得最佳的结果。为了满足您的研究需求,我们编撰了详细的要点提示和技巧知识库.

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概述

我们的阳离子脂质转染试剂可用于转染DNA、siRNA、Stealth RNAiTM siRNA、mRNA、Dicer生成的siRNA库或包含shRNA阅读框的质粒。也可转染寡聚核苷酸,蛋白与RNA。DNA分子可以为质粒、粘粒,甚至600kb长度的YAC克隆。

请参考转染试剂选择指南来进行正确的选择。

我们的转染试剂在常温条件下运送,用户一收到货需立刻将其放置4°C储存。在适当储存和操作条件下我们的质保期是从接受日起一年之内,除非管壁标签或COA(分析认证书)上另有说明。由于冷冻通常会降低转染试剂效能,我们不建议冻存转染试剂。。

请浏览此份关于常温条件运输Lipofectamine®转染试剂的相关文档

以下要点需要考虑:

  • 针对您的细胞类型来选择阳离子脂质体试剂以获得最高转染效率。请参考转染试剂选择指南进行正确的选择。
  • 优化阳离子脂质试剂和DNA的用量。除细胞状态以外最重要的因素是脂质体:DNA的比率。
  • 在复合物形成时不要使用血清。血清中可能包含干扰复合物形成的成分。我们建议使用Opti-MEM™减血清培养基来准备复合物。无血清DMEM或RPMI 1640培养基也可以用于复合物的形成,但是复合物形成的效率可能没有在Opti-MEM™减血清培养基里面高。
  • 不要使用含抗生素、EDTA、柠檬酸盐、磷酸、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸葡聚糖或其它硫酸蛋白聚糖的培养基来准备DNA-阳离子脂质体复合物。
  • 转染时的细胞密度应为50%至80%(对于Lipofectamine™ 2000转染试剂,推荐细胞汇合度大于90%)。细胞应处于对数生长中期。为了确保在实验组间获得最为稳定的结果,建议您最好能够用血球计数板或者Countess™ II FL(货号: AMQAF1000)等进行精确细胞计数。
  • 请确保转染的DNA中的启动子-增强子能够兼容靶细胞类型。
  • 不要使用冰冻过的,或在温度低于4°C的冰箱中储存的阳离子脂质试剂。
  • 请在转染实验中加入阳性对照(例如质粒DNA转染可以用Cat. No. A14146;siRNA转染可以用 Cat. No. 14750100 )。

同时,请参考此处列举的要点提示。

通常情况下,我们建议的对照包括:

  • 纯细胞组
  • 细胞+DNA或RNAi组
  • 细胞+脂质试剂组
  • 细胞+GFP质粒阳性对照组

这些对照对于同时检查细胞健康状态、试剂毒性和效能十分重要。

细胞系特异性的转染方案可点击此处查找。

如果您没有找到细胞系特异性的转染方案,或某一方案未能达到预期效果,我们建议您测试产品附带方案中的实验条件,来确定最优方案。成功的转染依赖于细胞类型、脂质用量、细胞健康度、传代次数和转染时刻的细胞密度。在不同的实验室之间,这些因素中的每一个都可能略有区别,这时用户就需要实施进一步的方案优化,来获得相同的转染效果。 

我们建议:使用Lipofectamine® 3000进行质粒DNA转染,使用Lipofectamine® MessengerMAX™进行mRNA或短寡核苷酸转染,使用Lipofectamine® RNAiMAX进行siRNA/miRNA的转染。

转染效率高度依赖于每孔使用的转染试剂的用量,不同试剂间的用量也有所区别。请查阅转染试剂附带的产品信息获取最佳的使用条件。

产品附带的转染方案将为您提供转染试剂每孔用量的最佳范围区间。在产品研发阶段,这一用量区间能够广泛适用于各类细胞系。如果您在特定细胞系上仍未获得理想中的转染效果,则可能需要更进一步的优化工作。请联系 techsupport@lifetech.com帮助您进一步优化转染方案。

我们的每份转染试剂方案均提供了一份表格,来帮助用户对转染体系进行扩大或缩小。请查阅特定的手册以获取细节信息。

聚丙烯、聚苯乙烯或玻璃管等都可用于阳离子脂质体:DNA复合物形成。

是的。细胞密度将影响转染效果。Lipofectamine® 3000Lipofectamine® 2000Lipofectamine® LTX/PLUS在70-90%汇合度的条件下能够达到卓越的转染效果,汇合度低于这一区间则可能出现一些细胞毒性。Lipofectamine® RNAiMAX在细胞汇合度为60-80%的区间范围内效果最佳。

细胞代数也会影响转染实验。我们推荐一致地传代和接种细胞。传代次数过多会降低转染效率。我们不建议使用传代次数超过20-30的细胞进行转染。如果转染效率降低,细胞培养时间过长或传代次数过多/未正确传代,我们建议您从液氮中取出一管细胞重新进行培养。请参考Gibco®细胞培养基础手册为细胞培养和传代选择合适的操作指南。

脂质体转染过程中不是必须采用无血清培养基。不过,脂质:核酸复合物一定要在无血清的条件下配制,因为(血清中的)蛋白质可能会干扰复合物的形成。一旦复合物形成,即可直接加至含血清培养基中的细胞中。

可以,转染过程中可在培养基中添加抗生素(青霉素-链霉素)。我们对多个细胞系在含与不含抗生素的培养基中的转染效果进行了比较,同时评估其转染效率和细胞毒性,结果显示并无差别。不过,某些细胞类型对转染过程敏感或可能出现细胞毒性方面的问题,此时省略抗生素可能会有助于改善结果。对稳定转染而言,转染操作后至少等待72小时以上,再加入选择性抗生素(表1)。

请访问每一类型试剂的产品页面,您可在在该页面底部找到参考文献列表。同时您也可以看到针对特定细胞系的参考文献列表。同时我们也建议您使用 www.highwire.org作为搜索引擎,来查询迄今为止使用我们转染产品开展研究的大量论文报道。只需在搜索条件中简单输入转染试剂的名称与您感兴趣的细胞系/应用即可。

我们建议您在所有细胞类型中使用Lipofectamine® RNAiMAX试剂转染siRNA。该产品是专门针对siRNA转染而研发,能够提供高的转染效率和低的细胞毒性。因此,您只需进行些许的优化即可达到理想效果。针对基于载体DNA的RNAi应用,我们建议使用Lipofectamine® 3000结合P3000TM增强剂进行转染。

我们提供了多款核酸纯化试剂盒来帮助用户制备去内毒素的DNA,PureLink® HiPure纯化试剂盒囊括了小抽(Mini)、中抽(Midi)、大抽(Maxi)、超大抽(Mega)和巨量抽提(Giga)等多种规格。这些试剂盒均通过专利的阴离子交换树脂材质来纯化质粒DNA,能够实现相当于2倍CsCl密度梯度离心的纯度。如需更多相关信息,请单击此处

瞬转克隆中的表达水平通常更高,因为瞬时转染细胞中包含的基因拷贝数更多(单一细胞中数百个拷贝)。稳转克隆通常只在基因组中整合了1-2个目的基因拷贝,因此表达水平较低。在某些情况下,稳转细胞中较低的表达水平是由于细胞中的重组蛋白持续表达时产生了副作用。

请浏览以下图表(表1):

注意:为了确定稳转筛选操作中的最优浓度,我们建议您绘制一条剂量-效应曲线或致死曲线。

 

当细胞置于不同的抗生素浓度条件下时,剂量-效应曲线是用来确定细胞毒性的一个重要工具。用于筛选抗性细胞的选择性抗生素的用量随着细胞类型和抗生素类型等多种因素的变化而发生变化。我们建议每使用一种全新(或不同品牌的)抗生素或更换所用细胞系时,均应绘制一条剂量-效应曲线。

剂量-效应曲线分析的实验大纲;

  1. 以25-30%的汇合度将细胞铺于孔板中。这意味着细胞仍处于分裂期,因此会对抗生素具有良好响应性。
  2. 使用生长培养基将待检测的抗生素稀释至一个较宽的建议线性浓度区间。
  3. 吸去细胞培养孔中的生长培养基。在每个培养孔中单独添加含抗生素的培养基,仅空置一组培养孔。在这些培养孔中加入不含抗生素的生长培养基。
  4. 在适当的生长条件下培养细胞(每3-4天更换培养基,以去除死亡细胞,再加入含抗生素的新鲜培养基),每日对细胞进行例行观察。在第10-14天,评估每一培养孔中的存活细胞数量。(此时段依赖所测试的抗生素类型;Geneticin®、潮霉素与ZeocinTM等抗生素需要3周时间才能杀灭细胞,因此等待10-14天是比较理想的。不过,杀稻瘟素只需要两周左右的时间即可杀死细胞,等待7-10天就已足够。)测试细胞存活率时,先吸去培养基,使用磷酸缓冲液洗细胞,之后使用0.5%的亚甲基蓝和50%甲醇对细胞进行染色20分钟。
  5. 将存活细胞数目对应所用抗生素浓度来进行散点绘图。绘制后的曲线即为剂量-效应曲线或称致死曲线。在所选时间段内能够杀死所有细胞的最低抗生素浓度即可用于后续的稳转筛选。

在正向转染过程中,细胞铺于培养孔之中,用通常的方式制备转染复合物并在第二天将其加入细胞培养物中。在反向转染过程中,在培养孔之中制备转染复合物,之后再加入细胞与培养基。反向转染比正向转染过程更迅速,因此是高通量转染的理想之选。在非高通量的转染操作中,通常正向转染对于大多数类型的细胞转染效果更佳。

可以。您可遵照标准的转染方案进行共转实验,保证混合物中的DNA总量不变即可。也就是说,如果您的实验方案中需要1 mg质粒,则两种需要共转染的质粒各取0.5 mg,或四种共转染的质粒各取0.25 mg。当共转染实验含有的另一个质粒上含有筛选标志物时,我们建议目的质粒与筛选质粒使用3:1至10:1的摩尔比,以确保目的质粒存在于筛选质粒阳性的细胞中。

• Lipofectamine® 3000与P3000TM试剂拥有专利配方。

• Lipofectamine® 2000试剂拥有专利配方。

• Lipofectamine® MessengerMAX拥有专利配方。

• Lipofectamine® RNAiMAX试剂拥有专利配方。

• Lipofectamine® LTX试剂拥有专利配方。

• Lipofectin®试剂为1:1 (w/w)比例配制的N- [1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)和中性脂质二油酰氧基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的混合物。

• Lipofectamine® 试剂为3:1 (w/w)比例配制的多聚阳离子脂质2.3二油酰氧基-N(2(精胺)乙基)-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯(DOSPA)与DOPE的混合物。

• PLUSTM 试剂拥有专利配方。

• DMRIE-C试剂为1:1 (M/M)配制的阳离子脂质DMRIE (1,2-二甲基丙基-3-二甲基 - 羟乙基溴化铵)与胆固醇的混合脂质体配方。

• Cellfectin® II试剂拥有专利配方。

  • Lipofectamine® 3000在多种细胞系中表现出最高的转染效率,其同时还适用于siRNA的转染和质粒DNA与siRNA的共转染操作。
  • Lipofectamine® 2000在绝大多数的贴壁细胞和难转细胞上都能取得很好的效果,可用于转染质粒DNA、siRNA和质粒DNA与siRNA的共转染。
  • 推荐使用Lipofectamine® MessengerMAX™进行mRNA或短寡核苷酸的转染
  • 使用Lipofectamine® RNAiMAX转染siRNA/miRNA可获得最好的转染效果。
  • 昆虫细胞建议使用Cellfectin® II试剂。

Lipofectamine® 3000是我们最好的转染试剂,强烈建议用其向各类细胞导入质粒DNA,其所适用的细胞系包括:

  • >60种细胞系(包括癌细胞系、成纤维细胞、神经细胞等)
  • 易转细胞
  • 难转细胞(包括神经细胞、干细胞、血细胞)
  • 悬浮细胞
  • 原代细胞
  • iPSC

请参见我们的验证过的细胞系列表。.

在某些种类的细胞中,Lipofectamine® 2000与Lipofectamine® LTX是可能达到更高效率的替代选项。需要解决细胞毒性问题时,Lipofectamine® 3000是我们最为温和的试剂,其细胞毒性显著降低的同时,转染效能也有提升。Lipofectamine® 3000和Lipofectamine® 2000均可用于共转(siRNA与质粒DNA)实验。

这些产品为不同的阳离子脂质配方。针对最为广泛的细胞类型,Lipofectamine® 3000为质粒DNA和siRNA的递送提供了最佳的转染效率。Lipofectamine® 2000是我们更早期的转染试剂,也能够胜任质粒DNA和siRNA的转染操作。Lipofectamine® LTX可在最低毒性情况下递送质粒DNA。Lipofectamine® PLUS是已停产的转染试剂,不过PLUS™ Reagent仍可供货和单独销售(货号 11514-015)。Lipofectin®是在1980年后期推出的开创性产品,被视为我们最早推出的转染试剂。我们持续为喜爱早期配方的用户提供这些产品,但建议所有的新客户首先尝试使用Lipofectamine® 3000以获取最优性能和最低毒性。 

为了成功完成质粒DNA和siRNA的共转染操作,我们建议您使用高品质的DNA,针对目的基因设计并经验证的siRNA,以及处于对数生长期的细胞。共转的方法或共转实验的应用十分重要,它们能帮助您确定递送顺序和挑选合适的转染试剂:

为了研究共转质粒所表达基因的siRNA敲低效率,可使用Lipofectamine® 3000及P3000TM增强剂来共转染质粒DNA和siRNA。如需确定质粒DNA,siRNA,Lipofectamine® 3000和P3000TM增强剂的共转染用量,请参考此手册 使用质粒DNA和siRNA单独转染时推荐的用量进行共转染实验。
2.如需研究内源基因的siRNA敲低效率,我们建议使用Lipofectamine® RNAiMAX转染siRNA。转染siRNA 4-48小时之后,可使用Lipofectamine® 3000转染质粒DNA。转染后递送质粒DNA的时间可能需要根据被敲低蛋白的半衰期来进行优化。
一旦基于具体应用确定了适当的递送方法,就可针对DNA、siRNA和转染试剂的用量进行优化。对于96孔板中HEK293细胞的转染应用而言,我们通常建议在每一反应孔中添加如下剂量:

  • DNA: 0.1–0.2 μg
  • siRNA: 1–3 pmoles
  • Lipofectamine® 3000: 0.1–0.3 μL

我们提供Lipofectamine® MessengerMAXTM转染试剂来帮助用户转染mRNA,本产品能够在神经元和原代细胞中提供高达5倍的DNA转染效率。

我们建议先采用Lipofectamine® 3000转染试剂进行质粒DNA的转染;如果效果不佳,建议尝试使用Lipofectamine® MessengerMAXTM转染mRNA。

Lipofectamine® 3000转染试剂

Lipofectamine® 3000试剂专用于提升难转细胞的转染效率,能够为最广泛的细胞种类提供卓越的转染性能。本产品同时还适用于质粒DNA,siRNA的转染和质粒DNA和siRNA的共转染操作。

是的,Lipofectamine® 3000转染试剂是不含动物源性成份的产品(AOF)。

可以,您可使用Lipofectamine® 3000转染悬浮细胞,其他难转细胞和原代细胞。请点击此处浏览相关数据。不过,如果您得到的转染效率较低,建议您使用Neon®转染系统或ViraPowerTM慢病毒递送系统。

可以,Lipofectamine® 3000可用于转染神经元、干细胞和血液细胞等原代细胞,如此处所示。

没有,本品适用于广泛的细胞种类,因此没有细胞类型特异性的转染方案。手册中同时提供了Lipofectamine® 3000低用量和高用量的优化转染方案,两种用量均显示出水平相当的转染效能。

Lipofectamine® 3000对基于载体的RNAi与合成siRNA的递送效果良好,也适用于siRNA与质粒DNA的共转染实验。不过,Lipofectamine® RNAiMAX是我们转染合成siRNA效果最佳的转染试剂。对体内siRNA实验而言,我们建议使用Invivofectamine® 3.0试剂。

对于未经修饰的标准siRNA、Silencer® siRNA、Stealth RNAiTM siRNA、Silencer® Select siRNA、Ambion® Pre-miR前体、mirVanaTM miRNA 模拟物、Ambion® Anti-miR 抑制剂与mirVanaTM miRNA抑制剂而言,只需使用Lipofectamine® 3000试剂即可有效递送至胞浆。此时无需使用P3000TM试剂。

对于质粒DNA、基于载体的BLOCK-iTTM shRNA或miRNA、ViraPowerTM HiPerformTM慢病毒表达载体,或GeneArt® CRISPR核酸酶载体而言,Lipofectamine® 3000试剂需与P3000TM试剂联用以确保高效的细胞核递送效果。

为了研究共转质粒所表达基因的siRNA敲低效率,可使用Lipofectamine® 3000及P3000TM增强剂来共转染质粒DNA和siRNA。请按照此手册中单独转染质粒DNA和siRNA的说明,使用等量的质粒DNA、siRNA、Lipofectamine® 3000与P3000TM增强剂。

Lipofectamine® 2000转染试剂

Lipofectamine® 2000 CD是Lipofectamine® 2000的100%(化学)合成版。因此,该产品不含动物源性成份。

使用Opti-MEM®培养基配制Lipofectamine® 2000:DNA复合物时,复合物在室温下6小时内保持稳定。如使用其他类型的培养基配制复合物,其稳定性可能稍低。

您可使用Lipofectamine® 2000共转染质粒和siRNA。请点击此处以获取转染方案相关信息。

Lipofectamine® LTX转染试剂

Lipofectamine® LTX专用于在最低毒性情况下递送质粒DNA。我们不建议使用该产品递送siRNA。

我们测试过四种原代细胞株:HuVec、NHFF(正常人包皮成纤维细胞)、MJ90和NDHF。我们观察到的转染效率在5-25%。我们建议您针对所用的原代细胞株,通过改变DNA和脂质的比例来优化转染效率。我们的建议是使用Lipofectamine® 3000,这一试剂能够良好兼容广泛的细胞类型。此外,我们也建议您使用Neon®转染系统和慢病毒递送方法。

我们测试了Jurkat和K562等悬浮细胞的Lipofectamine® LTX转染效率。我们在这些细胞上实现的转染率均低于5%。我们建议您使用Lipofectamine® 3000转染悬浮细胞,其他难转细胞和原代细胞。请点击此处浏览相关数据。不过,如果您得到的转染效率较低,我们则建议您使用Neon®转染系统或ViraPowerTM慢病毒递送系统。

Lipofectamine® LTX能够胜任载体RNAi的递送操作,不过对于合成siRNA的直接转染操作而言,我们还是建议您使用Lipofectamine® RNAiMAX。对体内siRNA实验而言,我们建议使用Invivofectamine® 3.0试剂。

PLUSTM试剂是用于预混合DNA的专利试剂。在多种真核培养细胞中,将PLUSTM试剂与转染试剂联合使用,能够提升阳离子脂质体介导的DNA转染效果。使用PLUSTM试剂,能够提升Lipofectamine®试剂、Lipofectamine® LTX试剂、Lipofectin®试剂、Cellfectin®试剂和OligofectamineTM试剂的转染效果。Lipofectamine® LTX中同时含有PLUSTM试剂,货号A12621,15338030和15338100。同时PLUSTM试剂也以单品形式供货(货号11514015)。我们不建议将PLUSTM试剂与Lipofectamine® 2000或Lipofectamine® 3000联用。

不可,在加入PLUSTM试剂之前使用培养基稀释DNA并进行混匀十分重要,否则DNA可能会出现沉淀。

Lipofectamine® MessengerMAXTM转染试剂

Lipofectamine® MessengerMAXTM转染试剂专用于向细胞转染mRNA。其在神经元和各类原代细胞中具有高达普通DNA转染试剂5倍的转染效率。之所以能够达到如此效果,主要是因为我们拥有了创新性的脂质纳米颗粒技术,该技术将mRNA的递送效果优化至前所未有的高度,同时免去了DNA入核的步骤。这就带来了一个附加的好处:使蛋白表达过程更为迅速并且无基因组整合风险。此外,使用mRNA CRISPR能获得了超出10倍的切割效率。

不含,mMESSAGE mMACHINE® T7 ULTRA转录试剂盒(货号 AMB1345)需要单独购买。

我们验证了TriLink EGFP mRNA对照(货号L-6101) [SA1],您可购买此款产品。

Lipofectamine® MessengerMAXTM转染试剂拥有极简单的单管实验方案。用户可购买mMESSAGE mMACHINE® ULTRA T7转录试剂盒进行转录,也可直接购买预制的mRNA(如GeneArt® CRISPR 核酸酶mRNA,货号A25640)。

可以,Lipofectamine® MessengerMAXTM转染试剂可用于同时递送质粒DNA和mRNA(在CRISPR技术中);不过Lipofectamine® 3000专为递送质粒DNA进行了条件优化,因此能够达到更好的转染效率。

mRNA转染技术相比DNA转染拥有许多优势,而且该技术具有细胞系特异性。

  • 能够实现更高的转染效率:如果您通过DNA转染方式在难转细胞中效率低于30%,换用mRNA进行转染就可能获得高达80%的转染效率。DNA递送的部分困难在于其转染过程须顺利达成多个步骤。为了成功实现细胞中的蛋白表达,通常情况下DNA需要转染进入细胞胞浆,再入核,转录为mRNA,输出细胞核,再于胞浆内被翻译为蛋白质。直接递送mRNA时,mRNA一进入胞浆即可被翻译为蛋白质。不过,如果您对目前所使用细胞上已达到的转染水平很满意,则无需换用mRNA转染。
  • 这是一种无基因组整合风险的无印记方法:mRNA转染是瞬时性的,不会入核,也不会发生与细胞宿主DNA整合的风险;目前正在探索这项技术未来应用于疫苗置换(vaccine replacement)和疾病模型发展的可能性。

此外,使用全新研发的Lipofectamine® MessengerMAXTM试剂进行mRNA转染可以在更广泛的细胞系(如原代神经元、原代肝细胞、原代成纤维细胞、iPS细胞、hNSC、mESC、Raw 264.7, SH-SY-5Y, HT-29)中获得更好的转染效率。这样就能够不依赖于所使用的细胞模型来递送最高数量的mRNA。

不需要,进行mRNA转染操作时无需使用专门的培养基,也无特殊限制。对于转染方案,我们只是建议用户在脂质与mRNA复合的过程中确保无血清或抗生素的存在。我们自身的转染方案中使用的是Opti-MEM® I减血清培养基(Reduced Serum Medium)。转染mRNA后无需更换培养基。通常的实际操作中,我们在转染后的首个24小时之内不更换培养基,这样是为了尽可能减少对细胞的操作。

是的,转染mRNA能够带来更迅速的蛋白翻译,因此蛋白表达也更快。对于某些细胞系,我们在转染后90分钟即观察到GFP的表达。此外,使用Lipofectamine® MessengerMAXTM试剂转染mRNA还能够延长表达的时程(转染后GFP表达可延续5天),这是因为该转染操作能够保护mRNA不受降解。

向细胞中转染mRNA的最佳试剂为Lipofectamine® MessengerMAXTM转染试剂,因为它在更大程度上保护mRNA分子免受降解,进而在广泛细胞种类中显示出最高的mRNA递送效率。请访问此页面获取更多相关信息。对组织或小动物模型而言,最佳试剂应为Invivofectamine® 3.0转染试剂,其所采用的纳米技术能够包裹并保护递送的负载物。Invivofectamine® 3.0转染试剂既可用于体外细胞转染,也适用于全身性静脉注射法或直接注射(如肌肉、肿瘤、心脏、大脑)。更多详细信息请见此处

此外,也可应用化学修饰的核酸合成mRNA,以提升mRNA的稳定性和进一步减少降解。设置一组阳性对照mRNA(如GFP mRNA)对于优化转染技术很有帮助。

 

我们并没有观察到细胞在包裹mRNA的脂质体复合物和DNA的脂质体复合物上有任何差别。转染过程包括脂质体与mRNA之间复合物的形成,随后细胞通过内吞作用吸收上述脂质体复合物。这一过程中脂质体会对mRNA起保护作用,同时辅助其脱离内涵体,从而释放进入细胞胞浆中。此时mRNA可即刻由核糖体进行翻译。mRNA本身可通过如mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra转录试剂盒一类的体外转录试剂盒进行制备,后者可向mRNA中加入5’端ARCA帽结构和3’端poly(A)尾,从而良好地模拟了内源mRNA。

Lipofectamine™ MessengerMAX™ Transfection Reagent is an animal origin-free transfection reagent, especially formulated for the delivery of mRNA, small RNA (eg.,CRISPR IVT gRNA, siRNA, or miRNA), and short dsDNA or HDR templates (0.5-1 kb). Lipofectamine™ MessengerMAX™ Reagent is an excellent reagent choice for CRISPR-mediated genome editing applications.

Lipofectamine™ MessengerMAX™ Reagent demonstrates low toxicity and high transfection efficiency for all cell types (easy or difficult-to-transfect, primary, and stem cells).

Lipofectamine™ MessengerMAX™ Reagent may be used for both single gRNA delivery or multiplexing (gRNA for multiple targets) purposes with high transfection efficiency when used with GeneArt™ Cas9 mRNA. For a detailed protocol, please refer to the GeneArt™ Cas9 mRNA manual. We recommend using either the Invitrogen™ GeneArt™ Genomic Cleavage Detection Kit (Cat. No. A24732) or Invitrogen™ GeneArt™; Genomic Cleavage Selection Kit (Cat. No. A27663) for mutant analysis.

We recommend using Invitrogen™ Lipofectamine™ RNAiMAX Reagent for the delivery of oligos. We do not recommend using Lipofectamine™ MessengerMAX™ Reagent for the delivery of single-stranded oligonucleotides for genome editing purposes; literature demonstrates that dsDNA HDR templates provide better directed results.

Lipofectamine® RNAiMAX转染试剂

我们建议使用Opti-MEM® I减血清培养基(货号31985062)。

Lipofectamine® 3000或Lipofectamine® 2000可用于siRNA和质粒DNA的共转染实验,而Lipofectamine® RNAiMAX并不适用。

PLUS™试剂与Lipofectamine® RNAiMAX联用时并不会提升转染效率。

BLOCK-iTTM Alexa Fluor®红色荧光对照品(货号14750100)可作为siRNA转染效率的指示剂。这一染料可通过为Alexa Fluor® 555、Cy®3、DsRed、Texas Red®或罗丹明荧光基团而设计的标准滤片组来进行检测。

We recommend using the Lipofectamine™ RNAiMax Transfection Reagent. Please access the protocol here. Both our mirVana inhibitors and Ant-mirs may be used at a final concentration of 5 nM for effective knockdown effects.

Invivofectamine™ 3.0 Transfection Reagent

You may perform up to 10 injections of 200 µL each of a 0.1 mg/mL siRNA complex solution (e.g., 20 g mouse, 1 mg (siRNA)/kg (body mass)).

The Invivofectamine™ 3.0 Reagent protocol was validated for delivery to the liver by mouse tail vein injection. However, it may be delivered to the spleen and pancreas via intraperitoneal method. For other organs, Invivofectamine™ 3.0 Reagent is the best choice when used with an established method of delivery.

Invivofectamine™ 3.0 Reagent-siRNA complexes may be stored up to two weeks at 4 degrees C.

The Invivofectamine™ 3.0 Reagent-siRNA complexes may be used without the 6-fold dilution, in concentrated form. However, the complexes should be either dialyzed or diafiltrated before use.

Invivofectamine™ 3.0 Reagent is an improved formulation with the following increased benefits:

  • Lower toxicity
  • Higher transfection efficiency with less siRNA; sustained knockdown up to 2 weeks
  • Increased stability
  • Shorter overall workflow; no dialysis or diafiltration needed

Invivofectamine® 2.0转染试剂

nvivofectamine® 2.0转染试剂是一种不含动物源性成份,基于脂质的体内RNAi转染专利试剂,专用于通过尾部血管注射向体内递送合成siRNA,在肝脏能够达到高效的转染效率。Invivofectamine® 2.0是体内递送Ambion® In Vivo siRNA和InvitrogenTM Stealth RNAiTM siRNA双链体的理想之选。Invivofectamine® 2.0通过较低压力递送小体积的siRNA试剂,且毒性较低,因此能够有效避免动物产生应激反应。siRNA也可与BLOCK-iTTM荧光对照联用以追踪siRNA的生物分布。

我们建议您使用质量尽可能高的siRNA。Invitrogen的体内级纯度siRNA,或经过高度纯化和脱盐的siRNA是获得良好实验结果所必需的。合成失败,额外的盐分,游离核苷酸和未经适当纯化的siRNA,均会导致体内转染结果不佳。

无菌技术对于体内转染实验的成功是至关重要的。在将siRNA复合物注入动物体内之前,所有试材均需是无菌的。

这很正常;只需通过轻柔震荡来重悬沉淀,即可按照建议用法继续使用。

我们建议以7 mg/kg作为实验的起始用量。这一用量相当于向20 g小鼠体内注射200 µL 0.7 mg/mL(即10 µL/g)的转染试剂。

Invivofectamine® 2.0针对尾静脉注射进行肝脏递送的操作经过了优化。

在配制复合物之前,您的siRNA须溶解于无RNA酶/DNA酶的水中并至少达到3 mg/mL。siRNA储存浓度低于3 mg/mL将导致低包裹效率。同时我们也建议您在使用Invivofectamine® 2.0试剂配制复合物之前对siRNA的浓度进行确认,以核实其准确浓度。用户可将siRNA重悬于无RNA酶/DNA酶的水中,测量经梯度稀释的多个储存液样本的260 nm OD值,并据此计算实际浓度。

是的,我们建议您至少先在体外以不同浓度测试3条不同的siRNA双链体,并将效果最好的siRNA双链体用于体内实验。当从体外转向体内实验时,再次确认该双链体的种属特异性也十分重要。

我们建议在体内实验中使用近交系,因为这些品系能够提供均一的实验背景,这样用户就能够更好地确定基因敲低效果及其下游效应。此外,我们也建议用户从合格的供应商处购买状态非常健康的实验动物。使用生病或状态不佳的小鼠可能会影响实验结果。

为了确保获得最佳结果和最低毒性,确定每一动物的体重十分必要,这样就能够提供准确的剂量信息,从而在多个动物之间保持一致的用药剂量。基于您所用siRNA的效价,在小鼠上的建议用量为5–7 mg/kg (IP(腹腔注射)或IV(静脉注射)。

我们建议每个处理组注射3-5只小鼠,以帮助评估一项实验结果的可重复性。

Invivofectamine® 2.0试剂用缓慢、均匀地方式递送;200 μL注射剂量应在10-20秒中之内完成。

我们不建议在注射前对小鼠进行麻醉,因为这一操作可能会对产品性能产生影响。

不必,在透析实验方案中,我们不建议在此步骤暂停。不过,您可以使用15倍体积的PBS稀释复合物,并将稀释后的复合物储存于4°C条件下,之后换用Amicon® 柱来进行渗滤步骤。

可使用其他的透析系统(如Slide-A-LyzerTM系统),只要满足截留分子量为8–10 kDa即可。不过,在透析操作后,您可能会观察到比Spectra/Por Float-A-Lyzer® G2 8–10 kD更大的透析体积。

可使用TFF及其他渗滤系统,只要满足截留分子量为50 kDa即可。

请检查柱体超载情况(我们建议每个柱体的载入量不要超过15至30 mL)。解决方案:将样本分装入两个柱体并重新离心。

可以,您可使用0.22 μm的孔径来执行这一过滤消毒操作。不过,我们建议最好从开始到结束一直保持无菌操作。

分离高品质的RNA对于整个体内实验的成功至关重要。请访问体内RNAi实验方案页面

我们建议您使用看家基因来进行归一化计算。看家基因的表达水平可能随着实验条件和/或组织类型的变化而变化。我们在HMBS和GAPDH两个基因上获得了对靶标基因表达水平最为稳定的归一化结果。

专用转染试剂

可尝试使用Lipofectamine® 3000来转染Jurkat细胞,但是如果使用Neon®电转系统可获得高达98%的转染效率。

我们推荐用Lipofectamine® 3000转染内皮细胞。

需要了解更多信息?敬请联系我们 ›