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General

应该在合适的选择培养基平板划线培养后再挑取单个克隆。

提示:

  • 不要直接从甘油储液接种到液体培养基。
  • 不要整管冻融,请用无菌牙签或者接种环挑取少量菌液。如果是克隆文库,则需要完全解冻,放置于培养基中扩繁。
  • 使用无菌技术以防储存液被污染。

抱歉,我们不提供pCMVSPORT6空载体。

收到订单后,我们的内部生产组会尝试培养克隆。如果克隆不生长,他们会尝试第二次培养克隆,如果依然失败则会告诉客户该克隆“不生长”。

cDNA克隆

如果您主要考虑的是质量和序列,我们推荐选择Ultimate™ ORF克隆。此外,这些克隆采用Gateway载体骨架,插入片段能方便地在多种宿主系统间穿梭。全长人类cDNA克隆和MGC克隆仅仅是5’和3’末端测过序的,但是全长人类cDNA克隆的优点是目的基因克隆在Gateway入门载体的骨架中。MGC克隆可提供人、小鼠和大鼠的;Ultimate™ ORF克隆可提供人和小鼠的,全长人类cDNA克隆只有人的。

用于人类全长cDNA克隆库的骨架载体为pCMV-SPORT6。它是基于Gateway克隆技术的哺乳动物表达载体,插入片段由CMV启动子驱动并在其两侧插入了attB1和attB2位点。构建的重组子可直接在哺乳动物细胞中进行基因的表达。

我们提供的cDNA克隆包含Ultimate™ ORF克隆,全长人类cDNA克隆,MGC克隆及GeneStorm 直接表达克隆。Ultimate™ ORF克隆,全长人类cDNA克隆和GeneStorm直接表达克隆是我们内部生产的,而MGC克隆是从外部获得并由ThermoFisher Scientific分销的。Ultimate™ ORF克隆全部经过测序并保证在氨基酸水平100%匹配GenBank序列信息,而我们提供的其它cDNA克隆没有此担保。

Ultimate™ ORF克隆使用的骨架载体为pENTR221,它是一种Gateway入门载体。插入片段(一个以ATG起始并以TAG作为终止密码子的开放读码框)两侧为attL1及attL2位点。构建好的重组子可直接用于和带有attR1和attR2的目的载体(DEST载体)一起进行Gateway LR重组反应。它与N端带标签的目标载体兼容,但不与C端带标签的目标载体兼容。为了表达C端标签,需使用标签开启技术(Tag-On-Demand技术)或者将TAG终止密码子突变。我们提供定制化的表达tRNA抑制子的载体以代替我们之前出售的Tag-On-Demand腺病毒产品。如果您对此服务感兴趣,请发电子邮件至 custom.services@lifetech.com .

GeneStorm直接表达人类克隆采用高效的ACE™(加速的克隆和表达)流程。此流程适用于高通量的PCR克隆,DNA测序及蛋白表达测试。使用只能扩增全长开放阅读框的基因特异的引物组对人类基因进行扩增。随后PCR产物经TOPO克隆到GeneStorm (GS)哺乳动物表达载体pcDNA3.1/GS中。

BAC/PAC克隆

BAC克隆为包含很大插入片段(>100 kb)的基因组克隆,可能包含几个基因,而cDNA克隆只包含一个开放读码框基因。BAC克隆适用于启动子及内含子/外显子分析,染色体定位及转基因小鼠制备。

我们推荐使用PureLink HiPure质粒DNA纯化试剂盒,mini、midi、maxi三种包装规格可选(货号K210002, K210003, K210004, K210005, K210006, K21007)。采用 用户手册附录 中的改进方案可以在纯化特别大的质粒时帮助提高产量。我们的PureLink HiPure BAC缓冲液试剂盒(货号K210018)提供了适用于BAC纯化的额外缓冲液。

CloneRanger™工具中不能使用基因名称或者Genbank登录号查找BAC/PAC克隆,而且 ThermoFisher Scientific公司没有对于这些克隆的序列或插入子的信息。

要查找/订购单个BAC/PAC克隆,您需要克隆地址(文库名称和克隆ID,或克隆在板上的位置)。例如:CTD-2320O4 = CITB D文库,Clone ID 2320O4,2320是板号,O代表行号,4代表列号。要订购此克隆,您需要提供货号(96012)及克隆地址(CTD-2320O4)。

有一些网站可以用来定位BAC/PAC克隆。下面列出了其中一些:

  1. 登录 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/
  2. 选择目标物种并点击“Tools”之下的“Cf”按钮以获得该物种的Clone Finder页面。
  3. 如果您知道基因名称,选择“Search by feature”;如果您知道位置,选择“Search by position”。
  4. 例如,选择“Search by feature”,输入“ITGA5”作为“Feature name”并点击“Go”。
  5. 点击“Find Clones”。
  6. 找到目标克隆文库,例如:RP23 (RPCI-23 Female (C57BL/6J) Mouse BAC Library)并点击最右侧的“Data table”图标。
  7. 在刷新后的窗口中,您会看到一系列包含ITGA5基因的BAC/PAC克隆(例如:RP23-427P19,此处克隆ID是427P19)。
  8. 打开CloneRanger™ ,选择“BAC Mouse RP23”库,输入克隆ID(此处为427P19),然后点击“Submit(提交)”查看我们是否有这个BAC克隆。如果是通过电话订购,请提供货号(RPCI23.C)和克隆地址(此处为RP23-427P19)。
  1. 登录 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/cyto/hbrc.shtml
  2. 根据基因位置(染色体编号),点击“FISH-mapped”之下的数字超链接(这一数字是指包含染色体上这一部分的克隆的个数)。
  3. 获得Locus编码(也叫Accession number)(ALnnnnnn或ACnnnnnn,此处“n”代表数字)。编码也可能是ALnnnnnn.mm或ACnnnnnn.mm(此处“m”是一个Cal Tech Plate Row Column Library D6数字,指示这一序列的修改版本)或得到STS编码,或BAC末尾编码。
  4. 使用“Find”命令,“CTRL- F”在文件中找到Locus编码或STS编码或BAC末尾编码从而找出克隆ID(位于克隆名称之下)。
  5. 打开 CloneRanger™ 工具,选择相应克隆库,输入克隆ID并点击“Submit”查看我们是否有这个BAC克隆。如果是通过电话订购,请提供货号和克隆地址。

酵母克隆

  1. 登录www.yeastgenome.org .
  2. 在右上角的快速搜素栏,输入您的基因名称(例如MTM1)。
  3. 您将进入一个带有ORF名称(例如MTM1/YGR257C)的页面,此处为:YGR257C。
  4. 然后您可以进入Yeast Deletions 页面并点击“Resources”链接,进入http://clones.thermofisher.com/deletions/
  5. 点击感兴趣的酵母背景的文本文件(例如mat alpha, homo, het, 等等)(此处为mat_a_041902.txt)。
  6. 搜索上述您找到的ORF名称(此处为YGR257C)并找到相应的记录编号。在这个例子中,它是记录编号7288。
  7. 打开CloneRanger™ 工具,选择“Yeast Deletion”库并搜索记录编号(此处为7228)并点击“Submit(提交)”查看我们是否有这个克隆。如果是通过电话订购,请提供货号(95400)和记录编号(此处为7228)。

或者,

  1. 登录http://uswest.ensembl.org/Saccharomyces_cerevisiae/Info/Index
  2. 在右上角的搜索框内输入基因名称(例如MTM1)。
  3. 在新窗口的列表内,点击“Gene”,然后点击“S.cerevisiae”。
  4. 在下一个页面,记录“Gene ID”(此处为YGR257C)。这是ORF名称。
  5. 点击“Gene ID”查看详情并确认关于基因的描述。
  6. 然后进入Yeast Deletions 页面并点击“Resources”链接,进入http://clones.thermofisher.com/deletions/
  7. 点击感兴趣的酵母背景的文本文件(例如mat alpha, homo, het, 等等)(此处为mat_a_041902.txt)。
  8. 搜索上述您找到的ORF名称(此处为YGR257C)并找到相应的记录编号。在这个例子中,它是记录编号7288。
  9. 打开CloneRanger™ 工具,选择“Yeast Deletion”库并搜索记录编号(此处为7334)并点击“Submit(提交)”查看我们是否有这个克隆。如果是通过电话订购,请提供货号(95400)和记录编号(此处为7288)。
  1. 登录www.yeastgenome.org.
  2. 在右上角的快速搜索栏,输入您的基因名称(例如MTM1)
  3. 您将进入一个带有ORF名称(例如MTM1/YGR257C)的页面,此处为YGR257C,也叫作ORF ID。
  4. 打开CloneRanger™工具,选择“Yeast GFP”库并搜索ORF ID(此处为YGR257C)并点击“Submit(提交)”查看我们是否有这个克隆。如果是通过电话订购,请提供货号(95700)和ORF ID (此处为YGR257C)。

或者,

  1. 登录http://uswest.ensembl.org/Saccharomyces_cerevisiae/Info/Index.
  2. 在右上角的搜索框内输入基因名称(例如MTM1)。
  3. 在新窗口的列表内,点击“Gene”,然后点击“S.cerevisiae”。
  4. 在下一个页面,记录“Gene ID”(此处为YGR257C)。这是ORF名称,也叫作ORF ID。
  5. 点击“Gene ID”查看详情并确认该基因的描述。
  6. 打开CloneRanger™工具,选择“Yeast GFP”库并搜索ORF ID(此处为YGR257C)并点击“Submit”查看我们是否有这个克隆。如果是通过电话订购,请提供货号(95700)和ORF ID (此处为YGR257C)。

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