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Do-it-yourself基因合成试剂盒

我们在生产过程中会采用不同的菌种,例如Top10或DH5α™。一般情况下,我们用dam+菌种进行培养。因此,你可能发现酶切受到抑制,因为Xba1对dam甲基化敏感。
请发送电子邮件到geneartsupport@lifetech.com对有错误的地方进行说明。请同时提供项目编号及载体编号(ID),以便我们将问题反馈给质检部门做进一步调查。

使用CorrectASE™酶过度酶切可能会导致DNA模板降解。

确保反应不超过60分钟。同时,确保在PCR步骤前反应物保持冰浴,否则反应物将有可能被CorrectASE™酶过度酶切。

根据实验方案,寡核苷酸储存液应该用1X TE缓冲液配制,其终浓度为100 μM。下一行建议将浓度为10 μM的引物各取5μl加到一起。根据研发同事的反馈,操作手册这样写是因为他们通常将冻干的寡核苷酸配制成浓度为100 μM的储液(由于EP管体积的原因)。但是你做实验时可能会需要用到浓度为0.15 μM的引物pool。这时,你可以将储液稀释到10 μM或者将引物pool按1:10稀释。

GeneArt®定点突变试剂盒

请参考以下建议:

  • 您使用的是什么聚合酶?对于两种突变试剂盒,我们都推荐使用AccuPrime™ Pfx DNA聚合酶——使用1个单位的聚合酶进行扩增。
  • 尝试优化退火温度及延伸时间。按经验法则,采用的退火温度一般是比引物的最低Tm值低5至10摄氏度,延伸时间按照每30秒延伸1kb来计算。您可以尝试不同的温度/时间优化您的反应。
  • 引物设计不合适会造成没有反应产物。我们推荐使用我们的工具降低可能的二级结构或增加引物长度。
  • 检查您使用的起始DNA样本质量。
  • 确保您在PCR反应中加入了足够量的DNA。

下面列举了引起这个问题的典型原因及解决方法:

  • DNA量太少:每50 μL反应最多可以加入50 ng DNA。
  • DNA质量差:重新纯化质粒。
  • 使用了不合适的DNA聚合酶:我们推荐使用1个单位的AccuPrime™ Pfx DNA聚合酶进行扩增。
  • PCR条件不合适:优化退火温度及延伸时间。
  • 引物设计不合适:使用GeneArt®引物与载体设计工具降低可能的二级结构或增加引物长度®

下面是引起此问题的一些典型原因及解决方法:

  • DNA甲基化酶失活或SAM失活:利用甲基化对照反应测试DNA甲基化酶及25X SAM的活性。
  • 使用了太多的DNA:每50 μL甲基化反应体系中DNA的量不要超过50 ng。
  • 过度扩增:将小质粒的PCR循环数降到12,或将中等长度的质粒的循环数降到15。

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