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GeneArt® Strings™DNA片段

GeneArt® Strings™ DNA片段是客户定制的、未克隆的双链线性DNA片段,它们的长度在100到3000 碱基对(bp)之间,是使用与GeneArt®高质量基因合成相同的工艺从合成的寡核苷酸组装而来。GeneArt® Strings™ DNA片段可以用来快速克隆您的目的基因。在5(小于1000bp片段而言)到8(1000至3000 bp片段)个工作日内,可提供200 ng以上的GeneArt® Strings™ DNA片段。GeneArt® Strings™ DNA片段可在线进行设计、序列优化以及订购,是您克隆构建表达质粒的一种经济、明智的替代方法。

GeneArt® Strings™ DNA片段是组装好的寡核苷酸进行PCR得到的扩增子;是基因合成过程的一个中间产物。这一过程形成一个片段库,并且需要进行克隆和筛选以找到正确的克隆。为确保片段库中含有正确的片段,GeneArt® Strings™片段在出厂前都是经过bulk sequence-controlled。
GeneArt® Strings™ DNA片段以干粉形式运输,可直接进行重悬和克隆。在使用前,我们建议将试管内的粉末离心至管底,向试管的底部加水以获得想要的浓度,然后室温孵育至少1小时(也可4摄氏度下孵育过夜)。接下来,我们建议小心重悬片段并立即使用。如需长期储存,重悬后的GeneArt® Strings™ DNA片段应分装并冻存在-20摄氏度。请避免反复冻融。
不同。100至1000bp的GeneArt® Strings™ DNA片段生产需要5个工作日,1000至3000bp的GeneArt® Strings™ DNA片段生产需要8个工作日。根据序列的性质不同,生产时间也会不同。
是的。我们建议使用GeneArt®网络门户进行订购,在这里您可以使用免费的基因编辑和优化功能修改序列以满足您的需求。在编辑和优化之后,请再次检查确认您的最终序列,确认其准确满足您后续实验需求(例如,片段可能的同源重叠或限制性内切酶位点以及克隆所需的缓冲液)。
不能。GeneArt® Strings™片段只提供A/C/G/T碱基。不能使用混合的简并碱基和修饰碱基(例如,次黄嘌呤核苷酸,尿嘧啶核苷)合成。如果您对DNA特定碱基进行随机化合成服务,例如定向分子进化实验,我们提供Directed Evolution服务。请参阅GeneArt® 可控随机进化服务和GeneArt®基于TRIM技术的组合文库

不是,GeneArt® Strings™ DNA片段仅能合成100至3000 bp范围内的片段。如果您的序列长度超过3000 bp,则需要订购基因合成服务或通过2个或更多个GeneArt® Strings™ DNA片段组装您的基因。另外,GeneArt® Strings™ DNA片段流水线生产,可以快速、经济地为您提供基因产品。如果您的序列比较复杂,可能会收到一条信息,告诉您Strings™ DNA片段由于序列的高度复杂性而不能生产。在这种情况下,我们建议修改您的序列以满足生产标准(后文给出)或使用基因合成服务合成您的基因。在很多情况下,使用门户网站功能优化您的序列即可满足GeneArt® Strings™片段的生产要求。如果仍然不能生产,您可以手动编辑序列以满足生产要求。

重要的生产标准有:

  • GC含量20至80%(仅指峰值GC含量,而非总含量)
  • 没有长的二级结构或重复序列
  • 没有>25 bp的A/T延伸结构,也没有>20 bp的G/C延伸结构

GeneArt® Strings™ DNA片段是寡核苷酸组装后进行的PCR扩增子,可直接用于筛选正确克隆。作为质量控制(QC)过程的一部分,我们对Strings™片段进行整体序列控制(bulk sequence-controlled)以确保您需要的序列包含在片段库中。

To identify a correct clone >为了使正确克隆的获得率>90%,我们建议您使用以下这些筛选指南:

  • 小于1 kb的Strings™片段:测序2-4个全长克隆
  • 1-2 kb的Strings™片段:测序3-5个全长克隆
  • 2-3 kb的Strings™片段:测序4-8个全长克隆

不提供,GeneArt® Strings™ DNA 片段不提供亚克隆或组装服务,因为其服务设计理念是为您提供获得基因的最快、最经济的方式。如果您不想自己克隆基因,我们建议您订购全基因合成服务。

可以,可以直接将两个GeneArt® Strings™片段组装起来,无需预克隆。我们提供好几种无缝组装技术,例如,GeneArt® Type IIs组装技术或GeneArt® Seamless克隆和组装技术。根据序列长度和您想要组装的片段数的不同,筛选阳性克隆的难度可能会很高。因此,我们通常推荐对亚片段进行预克隆以降低在组装后筛选阳性克隆的难度。
GeneArt™ Strings DNA文库

我们推荐这一网站: http://www.chick.manchester.ac.uk/SiteSeer/IUPAC_codes.htmL

这一问题的答案取决于您的项目细节。通常而言,文库的多样性越低越好,即仅针对基因/蛋白的几个可能在功能上比较重要的区域进行简并设计。下列信息可有助于决定哪些区域比较重要:晶体结构,保守基序,有无同源序列,等等。

传统的创建简并文库的方法(如易错PCR)引入了许多不想要的突变。并且一些方法(像DNA shuffling等一些方法通常不能产生直接相邻突变的组合。然而,合成组合文库可以将突变的引入限制在特定区域,并规定精确的发生频率。此外,相邻突变的重组将不受它们距离远近的影响。

在产生多样性时,TRIM技术允许替换整个密码子而不仅仅是改变单一核苷酸。因此,您可以完全控制哪种核苷酸出现在给定位置以及出现的频率,同时可以避免引入终止密码子。因为替换的是完整密码子,所以与其它突变技术相比TRIM技术还减少了移码突变。

我们通常使用针对适用于最常见表达宿主(人,CHO和E. Coli)的优化密码子。如需所有其它种类的密码子可以向我们索取并获得。

有以下原因:

  • 因为您已经知道某个特定氨基酸替换会破坏您的目的蛋白的功能(例如,互补决定区(CDR)的半胱氨酸)。
  • 因为一个蛋白可能的突变惊人的多,已经超过了最高通量的筛选能力的几个数量级。无用的突变——例如发生在蛋白非重要区域的突变或引起读码框移位或产生终止密码子的突变——越少,则找到想要的表型的突变的机率越大。
  • 一些筛选实验是需要成本和较多人力的,因此,筛选较少的克隆可以节省时间和金钱。
  • 组合文库(最多1,011个突变体):多个密码子同时随机化,TRIM技术可选
  • 位点饱和突变(最多20个突变):对单一密码子进行各种可能的非野生型随机化突变
  • 顺次突变文库(密码子数X20个突变):连续位点饱和突变
  • 可控随机化(最多1,011个突变):以固定频率进行无偏向性的随机替换
  • 所有已知人SH3结构域的cDNA克隆
  • 截短片段文库:用户定义的截短片段,不含移码突变
  • GeneArt™ Strings™ DNA文库:可包含最多3个区域的核苷酸随机化的线性DNA片段

如果您需要一个特殊设计的简并文库,请发送email到geneartsupport@lifetech.com。我们将评估任何项目并且大多数情况下将为您找到一个合适解决方案。

是的,GeneArt™组合文库可以使用任何您要求的核苷酸混合物进行随机化,给定核苷酸的百分比可以低至个位数(“脏瓶”法)。

不需要任何材料。为了创建文库,我们所需要的只是在线提交序列文件,以及您想进行随机化的位置信息和位点特征。我们可以通过我们的在线订购系统为您的项目提供报价(https://www.thermofisher.com/order/geneartgenes/projectmgmt)。如果有需要,您可以在项目开始前将有关您文库要求的细节信息提供给我们的合成科学家。

是的。要达到这一目的,请将您自己的载体或商业化载体寄给我们。

有两个标准化选择:

  • 作为一套线性DNA片段,可直接用于限制性内切酶消化和亚克隆。
  • 亚克隆到任意载体并以甘油菌和质粒形式运送给您。
  • 提高或调整启动子强度或特异性
  • 提高或调节蛋白稳定性
  • 修改或组合酶的特征
  • 提高受体、配体或抗体的结合亲和性
  • 优化或改变信号肽效率
  • 破坏蛋白功能而同时保留其免疫原性
  • 组合并选择天然多态性
  • 提高蛋白半衰期
  • 调整热稳定性

简并文库有三条重要的标准,并且在所有GeneArt™简并文库(不包括GeneArt™ Strings™ DNA文库)的质量控制中执行:

  • 非简并部分保持最大序列完整性
  • 简并位置达到最大序列变异性并达到所要求的核苷酸分布
  • 文库多样性最大化

 

GeneArt™ Strings DNA文库是一个具有以下参数的线性DNA片段文库:

  • 长度200 bp至 2000 bp
  • 最多3个随机化区域,每个最长30 bp
  • 随机化区域可包含所有IUPAC定义的模糊核苷酸(N, K, S, B等),不包含U
  • 随机化区域必须距离片段两端至少30 bp,并且互相之间距离至少30 bp  

注意:GeneArt™ Strings DNA文库不能使用TRIM技术和用户自定义核苷酸混合物。如果您要求上述类型的随机化,请咨询我们的其它文库产品。

GeneArt®基因合成:订购
  1. 首先输入您的基因序列,在您的目的基因两侧加入attB1和attB2位点。
    Edit sequence

  2. 保存并关闭。添加“Subcloning(亚克隆)”到您的基因合成项目。
    Edit sequence

  3. 亚克隆到pDONR221或pDONR/Zeo。翻至页面末尾并勾选“Add service(添加服务)”下的“Subcloning(亚克隆)”。
    Edit sequence

  4. 保存并关闭。您的进程将如下图所示:
    Scroll to Subcloning

  5. 选择您想把目的基因移入的pDEST载体,然后保存并关闭。
  1. 点击“Optimize Sequence(优化序列)”选项卡,然后选择“Protect Restriction Sites(保护限制性酶切位点)”或“Protect Sequence Parts(保护序列部分)”。
    Click on optimize sequece

  2. 选择您想保护的位点,或者输入您想保护的核苷酸序列。被保护的位点将显示在屏幕底部。点击“Optimization(优化)”选项卡,然后选择“Optimize(开始优化)”。
    Optimize
  1. 创建一个基因合成项目。
  2. 点击“Proceed to Summary(前进至总结)”选项卡。
    Click on optimize sequece

  3. 选择“Delivery Speed(送货速度)”,然后“Add to Cart(加入购物车)”。(请注意,如果“Add to Cart(加入购物车)”是灰色的并且只有“Send for Review(送至审阅)”是活跃状态,该项目必须被科学家审阅。点击“Send for Review(送至审阅)”,则您的项目将被分析。)
    Click on optimize sequece

  4. 您的项目的价格,以及估计的送货时间将显示出来。
GeneArt®基因合成

一个项目可以有多个流程,但是可以作为一个项目而订购。以这种方式订购的话则运输/操作费用将仅产生一次。

是的。我们可以将您的基因亚克隆到您提供的载体内。您将收到将您的目的基因分别克隆到GeneArt®克隆载体和您自己的载体的两个重组质粒各5 µg(以及两个载体的质量控制信息)。
GeneArt®基因合成服务包括基因优化(如果要求的话),合成DNA,克隆至我们的标准载体,以及提供5 µg冻干的DNA和一张包含计算机分析和质量控制信息的压缩光碟。
我们专利化的GeneOptimizer®软件计算编码目的蛋白所需的最优DNA序列(基因优化)。根据表达物种的密码子偏好改变基因的密码子使用情况(密码子优化)仅是基因优化的一个方面。GeneOptimizer®软件目前评估多达50个可能影响mRNA稳定性的因素,例如极端GC含量,核糖体结合位点,通用序列及潜在的剪接位点,重复序列,以及二级结构。mRNA分子稳定性的提高通常会提高蛋白产量。
GeneOptimizer®过程使用一种多参数的方法进行基因序列分析。它在进行基因序列优化时考虑密码子使用,GC含量,潜在剪接位点,直接重复序列,RNA二级结构,以及不稳定序列。
是的,您可以保护您不希望被GeneOptimizer®过程优化的特殊区域或限制性酶切位点。在门户网站,在“Optimize sequence(优化序列)”之下,选择“Protect Restriction Sites(保护限制性酶切位点)”或“Protect Sequence Parts(保护序列部分)”。
MyGeneObserver显示您的网络订单或非网络订单的制造进程,以及完成时间,以便您能够对您的基因合成项目进行追踪。

GeneArt® Strings™ DNA片段是未克隆的双链DNA片段,长度最长3,000 bp。GeneArt®基因合成的产品是已经被克隆在标准GeneArt®载体(pMx)内的双链DNA片段。请注意,一段序列可能因为重复序列或高GC含量而不能作为Strings™ DNA片段进行合成。在这种情况下,我们的科学家建议您通过基因合成订购您的基因。在某些情况下,您可以尝试使用GeneOptimizer®算法优化您的序列,有时也是能得以成功优化并作为DNA片段进行订购。

生产时间是基于基因长度和所选择的递送速度。请参见此链接获知我们的运输状况之间的差别。
试剂盒和定制服务有不同的优点。请点击此处查看一份对技术,递送和生产时间进行比较的选择指南,以决定哪种最适合您。

基因通常被克隆进pMx标准载体。这些载体包含:

  • 一个多克隆位点
  • 一个复制起始位点(colE1)
  • 一个抗生素抗性标记(氨苄青霉素,卡那霉素,链霉素,氯霉素);请注意标准订单不保证任何特定的标准载体。

请注意标准订单不保证任何特定的标准载体。

GeneArt®标准载体(pMx)无相关酶切位点的限制性内切酶列表


GeneArt®标准载体(pMx)图谱

在我们的标准载体构建过程中不能随意选择酶切位点进行克隆。在我们的生产过程中,内切酶的引入通常会切去标准载体上的大部分多克隆位点。多克隆位点中包含更多酶切位点的原因是为了允许在某些情况下由于插入序列内部的内切酶位点而需要选择其他酶切位点的情况。

没有,并且无法定制。您需要自行亚克隆到您选择的载体。作为定制服务的“Geneart®载体”部分,您唯一可选的是抗性标记(需要支付小额标记费)。

除您选择的内切酶位点之外,GeneArt®合成过程中添加了标准内切酶位点,用于自动化克隆到GeneArt®标准载体上。

是的,我们为每个GeneArt®合成产品保留一份样本。

理论上,没有限制。但是,非常长的DNA片段(超过10 kb)需要克隆进一个低拷贝载体以确保遗传稳定性。因此,长度的提高意味着生产时间的延长。

您将得到两个载体——连有目的基因的基本标准载体,连有目的基因的所选载体。

请提供5-10µg载体DNA用于您的GeneArt®用户定制服务。我们建议将DNA溶解在TE缓冲液或水中,或者作为沉淀固体运送。

对于合成有不同的监管/规则需要遵循,包括使用不同的实验室。在生物安全二级实验室,合成基因需要花费更长时间,因此这类项目费用更高。请注意,无论您如何选择,Thermo Fisher Scientific™公司和/或其附属机构都将进行生物安全评估。当您的选择为生物安全1级而我们的评估要求DNA在生物安全2级实验室合成时,您将收到一份根据生物安全2级要求修改的报价单供您审阅。

TSE代表Transmissible Spongiform Encephalopathy(传染性海绵状脑病),意味着无TSE标准的质粒制备所用的培养基是基于大豆的。

您通常会随订单收到下列内容:载体图谱,比对图谱,测序足迹图。扩展文件可能包括:

  1. 数据存储证明——保证存储所有生产指标数据
  2. 材料文件——包括所有使用过的化学物质的信息,包括供货商和货号
  3. GLP源文件——包括所有使用过的试剂按批号信息记录的材料颗粒度文件

您可以下载您的FASTA格式的优化序列。它可以作为txt文件/格式读取。FASTA文件将给出对于基因的简单描述,然后给出一个非注释版本的序列。您可以使用免费在线工具将该文件和原始序列进行比对,或者如果您有Vector NTI®软件的话,您可以使用它进行比对。

当预估的完成日期到达时,如果并不是所有的基因均合成完毕,则我们会送出部分订单。未完成的订单会分次按周发送。分批运送不会收取额外费用。

通常,我们会在预估最长完成时间的基因合成完毕后立即投递。在极少数情况下,订单在预估完成时间内没有全部发送。请注意,如果客户将基因合成和亚克隆作为一个过程订购,他们可能最先收到连到Geneart® 载体上的目的基因的克隆,然后收到克隆到客户提供的亚克隆载体上的重组质粒。

不需要,您的载体已经被入库并测序,并且在它们被订购/使用一次之后便会出现在您自己的“我的门户载体”列表中。

是的,我们将基于您选择的物种对该蛋白进行优化,为您的研究提供经过优化的基因序列。

有的,所有pMx载体包含一个M13 – 20引物结合位点和一个M13-R引物结合位点。其序列如下:

  • M13 – 20引物结合位点:5'-TTGTAAAACGACGGCCAG-3'
  • M13-R引物结合位点:5'-GGAAACAGCTATGACCAT-3'
GeneArt®突变

单一突变和突变簇(超过一个突变的过程)是针对一个母体基因的突变。突变的标准如下:

突变可以包括下列改变中的1到4个:

  • 5'/3'末端删除任意长度序列并在两侧各加入52 nt新序列
  • 5'/3'两侧各修改最多52 nt序列
  • 5'/3'两侧各延伸最多52 nt序列
  • 内部修改最多40 nt序列(最多允许3个内部修改单元)
  • 删除内部任意长度序列

注意:不同修改(无论是内部还是5´/3´)之间必须间隔至少100 bp。

如果一个基因的改变超出了这些标准,那么它必须作为一个单独的基因合成而不能作为一个突变来完成。

可以。将“single variant”作为新过程添加,然后选择“upstream service”(“gene synthesis”,“already at Geneart”,或者“I will provide this master gene”)。如果您提供的是您自己的基因,那么您将需要填写载体+插入片段的全部序列。如果它只是一个质粒,您将需要将突变区域填写为“insert”,而将质粒剩余部分作为“vector”。“插入片段”最长可以是4 kb。

GeneArt®亚克隆和快速克隆服务

使用另外一种生产过程,使用预制的表达载体,我们的GeneArt®客户定制服务团队可以将您合成的基因直接克隆到所选的Thermo Fisher ScientificTM™表达质粒之内,相比于先将基因克隆到pMx系列载体上的标准工作流程节省了4到5个工作日。请访问此页面查看快速克隆和传统克隆之间的区别。

您将收到克隆入选定表达载体的合成基因。请注意,不会再有传统GeneArt®克隆服务提供的连入pMx载体的基因。

目前有下列载体可用:

- pcDNA 3.1(+)载体

- pcDNA3.3-TOPO® 载体

- pcDNA3.4-TOPO® 载体

- pFastBac1 载体

- pET100/D-TOPO®载体

- pET151/D-TOPO®载体

- pRSET A载体

- pYes2.1V5-His TOPO®载体

 

适合于快速克隆的基因必须小于4 kb并且不复杂(对序列的优化可以降低复杂度)。

其他定制服务

请查看以下链接探索我们的合成生物学服务,其内容包含:载体构建,cDNA文库构建,蛋白表达服务,定向进化服务,质粒服务,以及细胞系和蛋白服务。

TALs是类转录因子的效应蛋白,是天然的转录激活因子。GeneArt® Precision TALs允许研究者选择它们想要功能化的精确DNA序列,并且据此构建特定的TAL基因以实现此目的。

GeneArt®定点突变试剂盒

两种试剂盒几乎相同,但是PLUS试剂盒包含一个改进的2X GeneArt®酶混合物,并提供了针对多点突变优化的protocol (最多3个位点,所用质粒最大14 kb)。PLUS试剂盒还可以用于在小于14 kb的质粒内进行最多25个核苷酸的单点突变,而原来的试剂盒只能用于最多12个核苷酸的替换/删除/插入。有一个网络工具可以用于引物设计,该工具也适用于原来的试剂盒。

  • GeneArt®试剂盒合并了甲基化和DNA扩增步骤,实验方案节省了1小时
  • GeneArt® 无缝克隆和组装试剂盒内的酶混合物是实验方案的一部分,可以大大提高了克隆的效率而无需进行很多轮PCR扩增(这是另一个节省时间的步骤)
  • 新试剂盒还包含一个应用于PCR步骤的增强子,可以提升突变效率,适用的质粒大小范围很广。

GeneArt®定点突变试剂盒内的DNA甲基化酶不作为单独产品出售。

引物长度在30-45 nt左右,突变位置应位于引物中央。根据突变的大小,突变两侧应至少有15-20 nt的侧翼序列,引物的长度不超过45 nt。我们建议使用我们的在线GeneArt®引物设计工具。

当在环形模板上进行第一个PCR循环时,聚合酶将生成两个能够退火并在下一个循环能进行引物延伸的线性产物(参见下图)。在两个末端引入了突变的PCR产物将在后续循环中累积。在PCR之后,PCR产物经过重组反应进行环化,从而进一步提高了突变效率。

GeneArt™ mutagenesis

通常而言,退火温度应该在55-64摄氏度,这也是AccuPrime™ Pfx聚合酶的PCR反应的推荐温度。引物的Tm温度将比退火温度高约5度。例如,随试剂盒提供的正链对照引物其退火温度是65摄氏度(最近相邻法)。

对于高GC含量序列我们建议减小引物长度,因为很高的Tm温度可能导致非特异性条带。之前有一个客户报告说使用Tm温度大约为80摄氏度的21-nt 引物获得了成功。

聚合酶对于阅读富含AT的区域是没有问题的。只有高GC含量区域对于聚合酶而言较为困难,因为其Tm较高。

GeneTailor™试剂盒(已停产)的引物设计指南将仍然工作,只要引物含有互相重叠的15-20个核苷酸的区域。但是,为了使引物设计更加直接,我们只建议用户转到使用GeneArt®指南。

这种情况最可能的原因是在PCR过程中由于引物形成发夹结构而产生了重排。您可以尝试提高PCR步骤的退火温度以减少二级结构形成。筛选更多的克隆也会有帮助。

通常而言,PCR增强子提高PCR产物的产量。它对于DNA甲基化没有任何作用。该10X增强子是针对Accuprime™ Pfx优化的,它对于其它聚合酶可能不起作用。如果您需要优化PCR条件(对于退火温度,延伸时间等),您可以使用AccuPrime™ Pfx酶进行标准体系优化,不需要加入增强子。

目前的试剂盒内没有提供DNA聚合酶。我们确实建议您在使用该试剂盒进行定点突变实验时购买AccuPrime™ Pfx DNA聚合酶,因为我们使用该聚合酶对反应条件和实验方案进行了优化。

This is most likely due to rearrangement caused by hairpin formation of the primer during PCR. You can try and increase the annealing temperature of the PCR step to relax secondary structure formation. Screening more colonies should also help.

For GeneArt™ mutagenesis services, we will need the DNA or amino acid sequence of the gene you would like to mutagenize, the host organism you plan to use (this is important for gene optimization if you choose to include it with your request), the restriction sites you need at the 5’/3’ ends and/or to avoid internally, and whether or not you want any other added motifs (e.g., Kozak sequence, stop codons, etc.).

Variants may contain up to four of the following modifications:

  • 5'/3' deletion of any length with additional 52 nt of new sequence on each side
  • 5'/3' modification of maximum 52 nt on each side
  • 5'/3' extension of maximum 52 nt on each side
  • 5'/3' extension of maximum 52 nt on each side
  • Internal modifications of up to 40 nt (a maximum of 3 of these internal modification blocks are allowed)
  • Internal deletions of any length
Note: Modifications (whether internal or 5´/3´) have to be separated by at least 100 bp


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