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TRIzol分离

DNA难以溶解最常见原因是DNA沉淀被干燥过度。DNA沉淀干燥一定不要超过5分钟。使用真空干燥设备除去洗涤液可能导致DNA沉淀干燥过度。真空干燥设备在抽走DNA沉淀中的空气时,也很容易导致DNA沉淀干燥过度。应避免使用任何类型的真空干燥设备除去DNA沉淀中的洗涤液,并将干燥时间限制在5分钟以内。如果您遵从以下简单建议,则可避免许多核酸溶解的问题。

使用灭菌棉球除去试管壁上的乙醇液滴。其他乙醇可通过使用灭菌毛细移液管尖接触DNA沉淀而去除。多余的乙醇将被毛细作用吸到移液管内。DNA沉淀中残留的乙醇不会产生负作用。通常,在DNA沉淀完全干燥前加入TE缓冲液或8 mM NaOH,可解决DNA溶解问题。DNA沉淀会在孵育5-10分钟后溶解而变透明。为了完全溶解DNA,可在定量前使用移液器反复吹打DNA溶液。

如需将干燥过度的DNA团块溶解,可以将其置于冰箱,并定期用移液器吹打至DNA沉淀变为透明并完全溶解于溶液中。

多糖为水溶性的,可随RNA进入水相。另外,在非过度干燥的情况下,受到污染的RNA和DNA沉淀比非常纯的沉淀更易溶解。在8 mM NaOH中不溶解的团块,也不会溶解于苯酚/氯仿溶液。

以下是DNA得率很低或者DNA发生降解的几种可能的原因:

  • 加入TRIzol后,样本未完全均质或裂解。如果在加入氯仿后有任何固体样品残留,DNA得率可能很低,因为DNA依然停留在非均质的样本中。您可以使用聚丙烯滤布过滤TRIzol匀浆(在液相分离前),从而去除未完全裂解的样品残留。
  • 最终的DNA沉淀未能完全溶解。溶解DNA可能需要数小时。在37°C孵育同时反复吹打几次可能对DNA的溶解有所帮助。同时,应确保DNA浓度不会过浓否则可能不能完全溶解。如果DNA未完全溶解,那么在离心时去除未溶解的胶样样品时,会损失一些DNA。
  • 动物或其他来源的组织,在获取后未立即处理或冻存。
  • 使用高速匀浆机匀浆样本。可能发生DNA断裂。
  • 如果预期得率<10 μg,可能是沉淀过程的物理操作本身的限制导致的。匀浆和/或清洗步骤可使用微载体(糖原、tRNA),或将样本合并以提高预期得率。
  • 如果您只关注DNA回收的产量,我们建议重悬时使用新鲜配制的40 mM NaOH代替8 mM NaOH;这会造成DNA的水解,但也会促进DNA沉淀的溶解。另外,匀浆后不要离心(在起始步骤中加入氯仿前),因为一些DNA会在离心时沉淀。如果团块是可滑动的,则初次离心的速度可增加到5,000 x g;这样会增加DNA的产量,但也会使DNA沉淀更难溶解,可能需要涡旋振荡并加热至50°C帮助DNA的溶解。

通常,吸光度低是由苯酚污染所致。可以使用含0.1 M柠檬酸钠的10%乙醇进行洗涤。提取后有苯酚残留并不罕见,提取物的A280值比预期的更高,会造成A260/A280比值较低。我们推荐采取二次乙醇沉淀去除残留苯酚。这也能去除多余的盐。完成上述步骤后,如果试管有苯酚的味道,则再次沉淀DNA。这一步很重要,因为苯酚会抑制下游的酶反应。

如果水相完全去除并向样本中加入乙醇,乙醇会因密度较低而位于TRIzol试剂的上方。如果未充分混合酒精及有机相就对样本进行离心,则在离心后乙醇位于TRIzol试剂的上方,DNA仍处于中间相,而TRIzol试剂位于底部的红色有机部分。如果没有恰当混合乙醇,则应继续混合样本,然后离心并继续完成DNA分离实验方案中的步骤1。

如果不慎加入了70%乙醇,则可能在有机相上方出现小体积的水相。由于实验方案所用洗涤液含有不超过30%的水,因此,在有机相上方出现的水层不会超过0.3mL的30%(90 µL)。您可在继续分离前尝试去除水相,但是DNA得率可能会降低。

如果在RNA分离过程中出现水相与有机相分离不完全,也会出现这种情况,原因主要有四个:1,氯仿混合不充分;2,样本离心时转速不合适;3,未达到需要的离心时间,4,离心温度错误。这些原因导致最终将从样本中回收到明显少于600 µL的RNA水相。液相分离问题通常出现于使用涡旋振荡来混合试管中的氯仿时。由于TRIzol试剂和有机相之间较大的密度差异,这些溶液很难完全被混匀,因此只能回收部分水相。当加入乙醇并再次充分混合样本时,将再次出现水相和有机相的分离,并且水相会出现于样本上方。

DNAzol试剂

可以,这种情况是由试剂中的染料所致,并且可能取决于储存试剂的体积。颜色改变不会影响性能。

不会,8 mM NaOH不会影响DNA的完整性。实际上,DNA在弱碱性pH(>7)环境中最稳定。您会发现,纯化的DNA在水中的溶解性并不是很好,在Tris缓冲液中的溶解度更差。(由于空气中的CO2溶于水,水的pH通常低于7。弱酸性的水实际上会引起DNA降解。)8 mM NaOH的pH约为9,一旦DNA溶解后,可以再用TE或HEPES调整pH。(由于暴露于空气时,二氧化碳会溶于溶液中,溶液也会随时间而变为中性。)

若您得到的A260/A280比值很低,应考虑以下几方面:

  • DNAzol试剂用量可能错误。如果将DNAzol试剂加入到细胞团块中,应确保试剂的体积是细胞团块体积的20倍。
  • 从DNA沉淀中去除粘性上清液的移液方式可能有问题,导致蛋白质污染。可使用DNAzol 试剂再次提取DNA,或使用苯酚萃取的方法去除蛋白质。
  • 在一些溶于水的样本中,水的pH值为酸性或低离子含量可能导致A260/A280比值较低。若样本溶于TE中,并使用TE(或1-3 mM Na2HPO4,pH约8.0)调零分光光度计,会使该比值升高。核酸的摩尔消光系数是在中性pH条件下得到的,这表明在中性pH条件下260nm处的吸光度最高。DNA在酸性环境中不稳定,若DNA长时间处于酸性环境中,可能会发生降解。

您可以尝试将样本溶于8 mM NaOH中,在37°C孵育过夜以帮助DNA的溶解。您也可以尝试在45°C孵育15分钟。

如果在分离DNA前使用磷酸盐缓冲液洗涤细胞或组织,则磷酸盐可能会抑制限制性内切酶。我们推荐向DNA溶液中加入DNAzol试剂,使用0.5倍体积的95%乙醇再次沉淀。沉淀后,使用95%乙醇洗涤2次,短暂干燥,并重悬于8 mM NaOH中。

如果DNAzol试剂的用量过少,则可能在加入乙醇后出现两相。应加入更多DNAzol试剂并继续实验。

颜色是因为加入DNAzol试剂前发生了细胞裂解。红色是由血红蛋白产生的。这种污染会导致PCR出现问题,因此,必须在乙醇洗涤步骤前去除颜色。以下是导致污染的可能原因:

  • 不充分或无效的抗凝血剂可导致血块形成;通常,这会使DNA出现斑点状外观。可在沉淀DNA前通过离心去除血块。
  • 未使用DNAzol BD洗涤液充分清洗试管壁。若试管壁的痕量蛋白质在乙醇洗涤过程中脱离试管,则会导致污染。

MagMAX™仪器

使用蘸有少量温和清洁剂、肥皂水或乙醇的软布或纸巾擦拭磁力棒。

96孔磁棒套未插入到固定器中,实验方案不会启动。

如果起始物料过于粘稠,磁力棒将不能收集磁珠。应稀释样本,并检查样本是否已经正确匀浆和裂解。

如果在运行期间点击“停止”,则可暂停;如果再次点击开始,则继续运行。如果点击停止两次,则运行完全终止,无法从实验方案的中间部分开始运行。

这种情况有时会发生,但这不会影响得率,因为样本已经从磁珠中释放出来。

可能原因是塑料96孔磁棒套的设计使其轻微弯曲。这就是为什么96孔磁棒套是成对包装的,这样可以维持形状。您可以手动调整96孔磁棒套的主干的弯曲度,并再试一次。

关闭仪器,检查是否存在可见损伤。确认使用了正在运行的实验方案对应的正确磁头。如果仪器无可见损伤,则再次开启。这样做时,应重置仪器。如果问题立即再次出现,则关闭仪器,轻轻将磁头装置移动到其传播路径中心,随后再次开启仪器。如果问题依然存在,应拨打维修电话请求重置磁头。

可以,请订购货号4489112

iPrep™仪器

请采用以下推荐步骤:

  1. 按键盘上的ESC键,回到主屏幕。
  2. 选择1进入手动屏幕。
  3. 选择2将枪头归位到固定器中。仪器会将所有轴线移动到原位。
  4. 关闭仪器,移除程序卡,重新插入程序卡,重启仪器,并在无试剂的情况下运行实验方案。

若仍出现相同的错误代码,尝试以下步骤:关闭仪器,移除程序卡,重新插入程序卡,重启仪器,在手动菜单中选择option 2,归还枪头。随后,在无试剂的情况下运行实验方案。

PCR产物回收

如果您的PCR管子保持打开的状态,并且PCR产物非常少,蒸发会造成分子排阻效应,导致回收效率低或者完全回收不回来。

一般可通过增加洗涤缓冲液体积来增加回收的最小片段的长度,同时确保长引物不会被洗脱。您必须通过一系列的梯度稀释实验来进行最适条件的优化。

ChargeSwitch包被的磁珠是惰性的,不会影响PCR使用。我们已经发现,多达10 µL磁珠不会对常规PCR实验产生负影响。超过~10 µL的过量磁珠会抑制PCR反应。一些特殊应用可能会受到磁珠影响,包括实时定量PCR反应或MALDI-TOF。在这些应用中,应重复实验方案中描述的最终洗脱结合步骤。

缓冲液已经过优化(通过使用毫摩尔级别的盐),从而避免蛋白质结合。我们的验证研究已经证明不会出现蛋白质结合。

琼脂糖凝胶提取

出现这种情况的原因有多种:

  • 所用溶胶缓冲液与琼脂糖质量的比例错误。当琼脂糖浓度低于2%时,每100 mg凝胶应使用300 μL溶胶缓冲液。当琼脂糖浓度高于2%时,每100 mg凝胶应使用600 μL溶胶缓冲液。
  • 溶胶温度低于50°C。
  • 没有每3分钟充分涡旋振荡样本一次。
  • 溶胶时间不足。
  • 琼脂糖凝胶片的质量大于100 mg。在这种情况下,切碎琼脂糖凝胶将加速凝胶的溶解。

得率低的原因有多种:

  • 使用多于400 mg的琼脂糖。这会降低柱子性能。
  • 所用溶胶缓冲液与凝胶的比例错误。当琼脂糖低于2%时,每10mg凝胶使用30 μL缓冲液。当琼脂糖浓度高于2%时,每10mg凝胶使用60 μL缓冲液。
  • 洗涤缓冲液中可能没有加入乙醇?乙醇是保证DNA结合到硅胶膜上所必需的。
  • 装有缓冲液W9的瓶子在不使用时没有拧紧。如果缓冲液W9中的乙醇含量因挥发而降低,则DNA回收的效率会越来越差。
  • 凝胶未完全溶解就加到柱子中。应确保凝胶在50°C下溶解,并且每3分钟混合一次。
  • DNA未完全洗脱。将TE缓冲液预热到65–70°C,可提高洗脱得率。
  • DNA是超螺旋结构。试剂盒中的洗涤液不能够将超螺旋结构的DNA从膜中洗脱出来。
  • 将试剂盒保存在4°C会影响试剂盒的效果。

以下是为您提供的一些建议:

  • 许多酶,包括限制性内切酶和连接酶,可被少量琼脂糖和高氯酸盐污染物抑制。正常情况下,这并不会对实验造成影响。但是,如果出现这样的问题,您可使用未经再纯化的DNA,通过增加消化或连接过程中酶的用量或通过延长消化或连接的孵育时间优化实验。另外,也可以在使用相同的反应体系和相同用量的限制性内切酶的情况下,减少消化或连接反应的DNA量。
  • 洗脱片段中可能有残留乙醇。一定要完全离心以去除洗涤缓冲液并丢弃,使用新试管收集洗脱的DNA。在对乙醇非常敏感的应用中,应将吸附柱打开后,在室温下直立放置15分钟,使多余的乙醇挥发。
  • 洗涤步骤可能未达到理想效果。在这种情况下,洗脱液中可能含有痕量高氯酸盐。为避免这种情况发生,可将离心时间延长至5分钟,并使用洗涤缓冲液洗2次。
  • 如果您使用了高浓度琼脂糖或向柱子中加入超过250 mg琼脂糖,应确保执行备选的洗涤步骤(可参考QC protocol)。在对EDTA敏感的应用中,应使用水(pH 7.5–8.5)或无EDTA的10 mM Tris(pH 8.0)洗脱。

电泳时产生的高热量或凝胶电泳速度过快,会导致多条带的出现。在凝胶上分析洗脱的DNA时,分离所得的DNA以多条带的形式出现。在50°孵育以溶解凝胶片时,富含AT碱基的DNA还可能发生变性。如果发生这种情况,可在37°C孵育20-30分钟并反复涡旋振荡,以溶解凝胶。

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