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常规凝胶电泳

琼脂糖因为无毒、易用且分离范围大而被广泛使用。我们提供预制E-Gel®琼脂糖凝胶,也提供试剂用于配制琼脂糖凝胶。聚丙烯酰胺凝胶通常用于对10–3,000bp大小的DNA分子进行高分辨率分析。我们提供预制Novex® TBE聚丙烯酰胺凝胶和UltraPure™试剂。

对于非变性RNA电泳,我们推荐使用 E-Gel® 预制胶电泳系统。请注意E-Gel® 琼脂糖凝胶并不保证完全不含RNA酶。但是,我们许多用户经常使用E-Gels®琼脂糖凝胶成功的完成了RNA分析。如果使用E-Gel®琼脂糖凝胶进行RNA电泳,可以使用任何适用于非变性DNA电泳的上样缓冲液。对于变性RNA电泳,可以从以下变性试剂中进行选择,包括甲醛、乙二醛、甲酰胺、甲基汞。变性条件会破坏氢键,因此RNA在电泳时没有二级结构,作为单链分子而迁移。

对于不用甲醛作为变性剂的RNA变性电泳,我们推荐使用 NorthernMax®-Gly 试剂盒(货号AM1946)。使用此试剂盒时,RNA样本在乙二醛/DMSO上样缓冲夜中变性,然后在含有乙二醛的琼脂糖凝胶中进行电泳。

完整RNA的28S:18S条带亮度比例应为2:1。你可能会在0.5 kb至9kb区间看到模糊的RNA拖尾条带,这表明样本中含有mRNA。请点击此处查看图片或了解更多评估RNA质量的信息。

使用乙二醛/DMSO代替甲醛避免了在通风橱中制胶及跑胶,同时避免了使用甲醛可能引发的安全问题。

琼脂糖凝胶

需要使用的凝胶浓度百分比取决于您希望观察的分子大小。

E-Gel®系统的E-Gel® SYBR®及溴化乙啶凝胶是使用离子交换基质的无缓冲液TAE系统预制凝胶。凝胶本身由一个UV半透过盒包围。

为了创造无缓冲液系统,每个E-Gel®盒内的凝胶与正负电极间包含两种独立的离子交换基质。离子交换基质提供缓冲离子库,为整个凝胶不断提供乙酸、Tris及乙啶离子。这项专利技术产生了一个持续的具有高缓冲能力的电场。E-Gel® 凝胶使您无需直接暴露于溴化乙啶,并无需配制及废弃液体缓冲液,从而节约时间并防止浪费。

抱歉,您不能单独订购E-Gel® PowerBase™ v.4。但是,下列E-Gel®入门套装中包含了这一款E-Gel® 底座和电源:

  • 含有SYBR® Safe™ 的E-Gel® 1.2% 琼脂糖凝胶入门套装,包含6块凝胶及E-Gel® PowerBase™ v.4,货号G6206-01
  • 含有SYBR® Safe™ 的E-Gel® 2%琼脂糖凝胶入门套装,包含6块凝胶及E-Gel® PowerBase™ v.4,货号G6206-02
  • 含有溴化乙啶的E-Gel® 0.8%琼脂糖凝胶入门套装,包含6块凝胶及E-Gel® PowerBase™ v.4,货号G6000-08
  • 含有溴化乙啶的E-Gel® 1.2%琼脂糖凝胶入门套装,包含6块凝胶及E-Gel® PowerBase™ v.4,货号G6000-01
  • 含有溴化乙啶的E-Gel® 2%琼脂糖凝胶入门套装、6块凝胶及E-Gel® PowerBase™ v.4,货号G6000-02

对于含有SYBR®及溴化乙啶的E-Gel®琼脂糖凝胶胶盒,我们推荐使用E-Gel® Opener(货号G530001)打开凝胶盒。E-Gel® EX琼脂糖凝胶、 E-Gel® SizeSelect™ 琼脂糖凝胶和 E-Gel® GO!琼脂糖凝胶可以用凝胶切刀 (EI9010)打开。我们不推荐打开E-Gel® 48琼脂糖凝胶胶盒或者E-Gel® 96琼脂糖凝胶胶盒。

E-Gel® EX琼脂糖凝胶能更快分离DNA,且具有更高的灵敏度,能提供额外的灵活性。EX凝胶染料是专利技术(并非基于SYBR® 技术),尽管它与SYBR®染料拥有相同的光谱特性。电泳时,E-Gel® EX凝胶需要使用E-Gel® iBase™电源系统,而E-Gel®琼脂糖凝胶既可使用PowerBase™ v.4也可使用E-Gel® iBase电源系统。E-Gel® EX凝胶的灵敏度比溴化乙啶高5倍。

E-Gel® EX琼脂糖凝胶可用于分离DNA或RNA。可以在非变性或变性条件下进行RNA的分离。请注意我们没有对凝胶是否含有RNA酶进行过质控检测。下面是分别针对非变性或变性样本进行电泳时的建议:

非变性条件
1. 将RNA样本与15 µL不含RNA酶的水混合。
2. 不要加热。将全部样本上样到E-Gel® EX琼脂糖凝胶上。
3. 电泳30分钟。

变性条件*
1. 将15 µL RNA上样缓冲液与 1–5 µL RNA(1–5 µg)混合。
2. 将样本在65°C加热10分钟,对RNA进行变性。
3. 加热后立刻将样本置于冰上。
4. 将全部样本上样到E-Gel® EX琼脂糖凝胶上。
5. 电泳30分钟。

*唯一与E-Gel® EX系统兼容的变性剂是甲酰胺,浓度在50–95%。65℃加热5分钟足以将样品变性。 E-Gel® EX琼脂糖凝胶电泳时,使用其它的变性剂,如乙二醇、甲醛或尿素会导致分离效率极低,且带形极差。此外,我们不推荐在同一块凝胶上同时电泳混有RNA上样缓冲液的样本和混有水的样本。

您可以使用我们的E-Gel® SizeSelect™ 琼脂糖凝胶及E-Gel® CloneWell™琼脂糖凝胶,它是双排胶孔的预制琼脂糖凝胶,提供简化的DNA回收方法。将您的样本加入上排胶孔并进行电泳,直到您的条带或所需大小范围的片段进入下排胶孔。然后使用加样枪吸出选定大小的DNA。不需要额外的凝胶纯化步骤。

是的,在您感兴趣的条带跑入收集孔前请确保第二排胶孔已加入无菌水。请注意:各孔再填充的体积可能会不同。不要加过满而溢出。

没有,我们测试过在E-Gel®琼脂糖凝胶所有上样道加水及仅在样本道加水,结果并未观测到明显的差异。但是对于E-Gel® CloneWell™琼脂糖凝胶和E-Gel® SizeSelect™琼脂糖凝胶,根据使用手册加水则很重要。

高通量E-Gel®琼脂糖凝胶有交错的胶孔,而且其电泳是基于中性pH值的内部缓冲系统,而非基于离子交换基质。高通量E-Gel®琼脂糖凝胶不能被打开,而且要使用E-Gel® E-Base™系统而不是iBase™或PowerBase™系统进行电泳。

我们的UltraPure™琼脂糖是标准熔点琼脂糖,适用于DNA和RNA片段的常规分离和分析,分离范围为500–23,000bp。UltraPure™琼脂糖1000是特制的琼脂糖,为PCR片段和其它短DNA片段提供较高的分辨率。我们也提供UltraPure™低熔点琼脂糖,其熔点为65°C或更低,非常适于分离10至1,000bp的DNA片段。

E-Gel® 48凝胶与E-Gel® 96凝胶使用了具有专利的中性内部缓冲系统,它具有强缓冲能力及低电导特征。此外,它们都不含离子交换基质。

EG程序用于E-Gel® 96和48凝胶电泳,而EP用于E-PAGE™ 96和48凝胶电泳。

母基座可以插到墙壁上的电源而子基座是连到母基座上使用的。1个母基座上最多能连接20个子基座同时进行电泳。

您可以使用我们的E-Editor™软件,完成电泳后它能帮您调整图象。E-Editor™ 2.0软件只适用于PC操作系统,而更早的E-Gel® 96编辑软件仍适用于 Mac®操作系统并能对 E-Gel® 96和E-PAGE™ 96凝胶电泳图进行调整。不过原来的软件不适用于E-Gel® 48或E-PAGE™ 48凝胶。请前往www.lifetechnologies.com 在搜索框输入“E-Editor software”下载E-Editor™软件。您可以使用E-Gel® 成像系统进行数据分析。

微波加热时,ReadyPouch™琼脂糖溶液在大约90 秒钟时开始沸腾,继续加热会在保护袋内持续温和沸腾。甚至5分钟后,液体也不会沸溢。如果长时间微波,液体最终会挥发。

盛放ReadyPouch™琼脂糖的塑料包装袋是不易传热。与玻璃不同,塑料包装袋在微波加热时仍能保持低温,因此当琼脂糖沸腾并接触包装袋边缘时,它接触到的是低温的部分,于是不会过分沸腾造成沸溢。另外,塑料不像玻璃那么硬质和光滑。不光滑的内表面能形成略为粗糙的表面区域,使得沸腾较为温和,而不像光滑表面会形成大的爆炸性的气泡。

1% ReadyPouch™ 琼脂糖凝胶的强度≥ 1,200 g/cm2

ReadyPouch™琼脂糖是标准熔点多用途琼脂糖,适用于100-8,000 bp DNA和RNA片断的常规分离。

ReadyPouch™琼脂糖在15至30摄氏度(60-80华氏度)的推荐储存温度下储存时间为6个月。

TAE缓冲液是最常用的电泳缓冲液,适用于电泳分离中等及较大的PCR扩增产物。TBE里面的硼酸是一种已知的酶抑制剂,会影响下游的酶促反应,如连接、克隆和蛋白表达,而这些反应都需要从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段。以后的产品线可能考虑增加其它浓度及缓冲液的产品。 

溴化乙啶储存在1 mL的塑料滴管中,浓度为0.625 mg/mL。我们推荐每袋琼脂糖加入两滴溴化乙啶使得凝胶中的溴化乙啶浓度为0.5 µg/mL。

一旦凝胶被使用后,不建议对袋中剩余ReadyPouch™琼脂糖再次加热。每次微波加热后(假设每次微波加热的时间相同)琼脂糖溶液的体积减少约10%。

E-Gel® 成像系统——凝胶记录

请点击此链接查看E-Gel® 成像系统的参数信息。

E-Gel®成像系统有三种基座可选:

  1. 蓝光透射基座——非常适用于新型DNA染料,如SYBR® Safe™染料,SYBR® Green染料,以及E-Gel® EX琼脂糖凝胶中使用的染料。
  2. 紫外透射基座——最适于传统的溴化乙啶染色。
  3. E-Gel®适配器基座——一种与E-Gel® Go!™系统或者E-Gel® iBase™/E-Gel® Safe Imager™系统兼容的实时凝胶记录基座。

Y是的,你需要购买E-Gel®成像仪白光转换屏(货号:4473061),它能将蓝光透射仪发出的蓝光或者紫外光透射仪发出的紫外光转化为白光。这一转换屏与多种蛋白染料兼容,包括SimplyBlue™ SafeStain、SilverQuest™ 银染试剂及Coomassie®亮蓝染色试剂。

使用SYPRO® Ruby蛋白凝胶染色剂不需要白光转换屏。他们可以使用E-Gel®成像系统Qdot® 625滤光片进行观察(货号:4466607)。

这些E-Gel®成像系统滤光片是可替换滤光片,您只需取出通用滤光片盘并插入自己选择的滤光片盘就可方便的使用。我们提供一种橙色E-Gel®成像系统通用滤光片,一种适用于SYBR® Green染料和SYBR® Safe™染料以及E-Gel® EX琼脂糖凝胶所用染料的绿色滤光片,以及一种适用于我们的Molecular Probes® Qdot® 625产品的红色滤光片。

E-Gel® Go!基座是一个低通量可编程的设备,专为E-Gel® Go!琼脂糖凝胶电泳设计,每片E-Gel® Go!凝胶包含4条泳道。此凝胶有1%或2%两种琼脂糖浓度可选,并配有专利的DNA染料。使用此凝胶电泳15分钟即可实现完全分离。该系统提供便携的电池包或汽车适配器以方便您的使用。

E-Gel® iBase™电源系统与所有E-Gel®琼脂糖电泳兼容,包括E-Gel® CloneWell™、E-Gel® SizeSelect™、及E-Gel® EX 凝胶,但是E-Gel® 96或E-Gel® 48凝胶除外。

E-Gel® PowerBase™ v.4系统与配有SYBR® Safe™ 染料或溴化乙啶的E-Gel®琼脂糖凝胶兼容(有单排胶孔和双排胶孔两种规格可选)

每个泳道或者每个条带推荐的DNA上样量为20–100 ng。对于大部分E-Gel®琼脂糖凝胶来说每个条带DNA上样量最多为500ng,而对于使用SYBR® Safe染料的E-Gel®凝胶,每条带的DNA的上样量最多为700 ng。

E-Gel® Safe Imager™实时透射仪加载到E-Gel® iBase™电源系统上,可对在含有SYBR® Safe™染料的E-Gel®琼脂糖凝胶上DNA/RNA的迁移进行实时观察。Safe Imager™ 2.0蓝光透射仪是专为在实验台上观察已染色凝胶而设计的独立系统。

请见下表中的仪器技术指标:

  • 仪器尺寸:195 × 325 × 65 毫米(11.6 × 12.8 × 2.6 英寸)
  • 显示屏尺寸:190 × 190毫米 (7.5 × 7.5 英寸)
  • 光源:发光二极管(LED)产生集中在470nm周围的激发峰
  • LED寿命:50,000小时
  • 符合欧共体安全要求
  • 包含1级LED产品
  • 包含配件: 琥珀色滤光片组,观测眼镜,及国际电源线

HR代表较高的分辨率。此电泳持续30分钟,常用来分离大小接近的条带。

上样缓冲液是可选的。如果没有使用缓冲液,样品可直接加到孔内,或者你可以使用去离子水或者TE缓冲液稀释样本。如果你想使用上样缓冲液,请参考以下配方:

E-Gel® 琼脂糖凝胶(包含EX)
10 mM Tris-HCl, pH 7.5
1 mM EDTA
0.005% 溴芬蓝
0.005% 二甲苯青 FF

E-Gel® CloneWell™和E-Gel® SizeSelect™凝胶
10 mM Tris-HCl, pH 7.5
1 mM EDTA
此外,您可以使用 10X BlueJuice™上样缓冲液或 TrackIt™上样缓冲液。对此缓冲液进行50倍到200倍稀释以获得最佳E-Gel®琼脂糖凝胶电泳结果。

这里是一份建议的实验方案:

  • 使用5XSSC缓冲液预先润湿一块适用于RNA的尼龙膜。
  • 使用E-Gel® Opener,从胶盒内移出E-Gel®琼脂糖凝胶。
  • 将凝胶在5X SSC,10 mM NaOH中室温浸泡2次,每次10分钟。
  • 使用标准技术,以5X SSC, 10 mM NaOH为转移缓冲液组装一个毛细管转移装置。
  • 转移完成需要两小时。将膜从转移装置中移出。
  • 将膜在5X SSC中润洗5分钟。
  • 将膜放在滤纸上干燥(2-4分钟)。在真空下于80°C烤膜30分钟,或使用UV交联仪将RNA固定在膜上。
  • 将膜放在两片印迹纸中间并密封于一个杂交袋中。保存在阴凉干燥处。

以下是该系统的技术指标:

  • 连接:USB2.0
  • 相机电源:AC: 100–240V, 50–60 Hz; DC: 7.5 V 2.0 A
  • 相机罩尺寸:35.6 cm (高) × 28.4 cm (长) × 20.3 cm (宽)
  • 电力要求:100–240 V, 50/60 Hz, 0.6 A
  • 温度:室温± 5°C到40°C
  • 基座尺寸:11.9 cm (高) × 30.4 cm (长) × 21.4 cm (宽) (此处是指整个基座)
  • 观察表面尺寸:15 cm x 12 cm (此处是指放置凝胶的区域)
  • 适配器技术指标:只能使用与E-Gel® 成像仪相机罩(100–240 VAC, 50/60 Hz, 0.6 A)同时提供的UL清单中的适配器。
  • 重量:1 kg

两种软件都同时随E-Gel®凝胶成像系统系统提供。GelCapture™软件用于在成像过程中对相机罩进行控制并在拍照后对图像进行基本操作。GelQuant™ Express软件用于在成像结束后对图像进行分析。这包括对目的条带的大小和相对或绝对亮度进行估计,以及在有需要时生成一份整张凝胶的数据报告。GelQuant™ Express软件仅能在密码狗(HASP密钥)插入电脑的USB插口上时才能使用。

对于E-Gel®成像仪,我们推荐使用紫外光基座和E-Gel®成像仪通用滤光片观察EB凝胶,使用蓝光基座和E-Gel®成像仪通用滤光片或紫外光基座和E-Gel®成像仪UV/SYBR® 滤光片(绿色滤片)观察SYBR®凝胶。

在Beckman Coulter's Biomek® FX工作站上使用E-Gel® 96琼脂糖凝胶和E-PAGE™ 96凝胶进行电泳的自动化脚本可在我们的网站上找到:www.thermofisher.com/egels(在左侧导航窗格内点击Labware Definitions链接)。

聚丙烯酰胺凝胶

请参见以下配方。
TBE电泳缓冲液(5X):
Tris碱, 54.0 g
硼酸,27.5 g
EDTA(游离酸),2.9 g
加去离子水至1.0 L

Hi-Density TBE上样缓冲液(5X):
5X TBE电泳缓冲液(货号LC6675)),2 mL
Ficoll® Type 400, 1.5 g
溴酚蓝,1 mL1%溶液
二甲苯青1 mL1%溶液
加去离子水至10.0 mL

凝胶的保质期是8周,应保存于4°C。

请参见下列凝胶技术指标:
凝胶基质:丙烯酰胺/双丙烯酰胺
凝胶厚度:1.0 mm和1.5 mm
凝胶尺寸:8 cm x 8 cm (高x 宽)
胶盒尺寸:10 cm x 10 cm(高x 宽)

电压:200V恒定电压
起始电流大约为:10–18 mA/凝胶
结束时电流大约为:4–6 mA/凝胶
电泳时间:大约30–90分钟,取决于凝胶的浓度。当溴酚蓝(深色)示踪染料到达凝胶的底部时电泳结束。
*可以使用最高250 V的电压以减少电泳时间。

可以,对于EB染色,将凝胶在超纯水配制的2 µg/mL EB溶液中浸泡20分钟。接下来使用超纯水进行3次洗涤脱色,每次10分钟。在紫外光下观察条带。

我们的TBE凝胶中EDTA浓度是0.06% (质量/体积)。20% TBE凝胶包含4%甘油以获得最大分辨率。所有其它TBE凝胶均仅在凝胶底部9%的范围内含有0.8%甘油,在凝胶的其它部分没有甘油。

在Novex® 10% TBE凝胶上,51 bp的marker条带清晰可见。在Novex® 20% TBE凝胶上,18和12 bp的marker条带清晰可见.

该系统可以使用多种上样缓冲液配方;但是,我们发现根据上样缓冲液的不同,电泳条带的形态会有很大的不同。在评估了尿素、福尔马林以及各种缓冲液系统之后,我们发现使用尿素、Ficoll®和TBE缓冲溶液能获得最清晰、最整齐的条带。使用含福尔马林的上样缓冲液将得到模糊、不清晰的条带。

我们提供两种优化的TBE-尿素上样缓冲液:Novex® TBE-尿素上样缓冲液包含两种示踪染料,而Novex® Prep TBE-尿素上样缓冲液不含示踪染料。Novex® TBE-尿素上样缓冲液适用于电泳分析,而不含示踪染料的Novex® Prep上样缓冲液适用于在割胶前会使用UV投影观察目的条带或当示踪染料会影响寡核苷酸条带的情况。

Novex® 6% DNA阻滞凝胶包含0.5X TBE。两种凝胶均能用于凝胶阻滞实验;但是,Novex® 6% TBE凝胶内的1X TBE有更高的离子环境,可能会影响DNA-蛋白相互作用。Novex® 6% DNA阻滞凝胶内的0.5X TBE通常效果更好,因为它在电泳中有较高的片段分离效果而且其离子强度较低,可以促进DNA-蛋白相互作用。

凝胶迁移实验是一种使用非变性PAGE的测定DNA结合实验。它提供了一种简单、快速并且非常灵敏的检测序列特异性DNA结合蛋白的方法。蛋白与末端标记的DNA片段结合形成一个独立的蛋白-DNA复合物。你可以用此方法检测纯化蛋白或粗提取物中的未知因子与DNA的结合。该方法也可以实现对DNA结合蛋白的亲和性、丰度、结合速率常数、解离速率常数,以及结合特异性进行定量分析。

超迁移实验是凝胶迁移DNA结合实验的一种变形,它使用抗体检测蛋白-DNA复合体中的蛋白。向一个结合反应内加入一种特异性抗体可能会产生下面几种效应。如果被抗体识别的蛋白与复合体的形成无关,那么加入抗体应当对电泳没有任何影响。如果形成复合体的蛋白被抗体识别,那么该抗体或者将阻止复合体的形成,或者将形成一个抗体-蛋白-DNA三元复合物,从而导致蛋白-DNA复合体迁移率的进一步下降(超迁移)。在蛋白结合DNA前还是结合后加入抗体,结果可能会不同(特别是当抗原表位是在蛋白与DNA结合区域时)。

Northern印迹

这里是一些建议:

  • 因为碱性转移可能使小RNA过度水解,从而降低它们结合,所以转膜不要超过4小时。
  • 凝胶倒得越薄越好(通常5–6 mm)。
  • 我们建议每毫米凝胶厚度对应的转膜时间是15-20分钟。
  • 交联(使用紫外线)或烤膜(100°C 10分钟)非常重要,这是为了将核酸不可逆的结合在膜上。

ULTRAhyb®-Oligo溶液包含25%福尔马林,只和带正电或中性的尼龙膜相互兼容。

我们建议根据我们的mirVana™ miRNA提取试剂盒(货号AM1560, AM1561)内的说明进行miRNA Northern印迹。我们建议使用起始量2 µg的总RNA或1 µg 富集的miRNA样本。使用变性聚丙烯酰胺凝胶对你的样本进行电泳,因为RNA可能由于分子量太小而在琼脂糖凝胶上检测不到。使用电印迹法将RNA转移至尼龙膜上。说明手册中提供了推荐的预杂交、杂交以及洗涤缓冲洗的组成。

请访问我们的网站查看我们的探针标记图表。

是的,我们提供mirVana™ miRNA探针制备试剂盒(货号AM1550)和mirVana™探针和Marker试剂盒(货号AM1554)。

是的。你可以用15%变性聚丙烯酰胺凝胶对小RNA,例如miRNA和siRNA进行Northern分析。为获得最好的结果,您应该使用针对于短探针的杂交缓冲液,例如ULTRAhyb®-Oligo溶液。为获得更灵敏的检测,您可以对RNA样本中小RNA进行富集(例如,使用 mirVana™ miRNA提取试剂盒或 mirVana™ PARIS™ RNA和天然蛋白纯化试剂盒)。当然,使用杂交试剂盒例如mirVana™ miRNA检测试剂盒对RNA进行检测可以提供更大的灵敏度并可以同时检测多个小RNA。

使用较小的10 cm凝胶进行Northern印迹需要30-90分钟,大大快于使用较大的凝胶。但是最大的时间节省步骤在于转膜步骤。传统上,Northern印迹使用毛细管转膜法和高盐缓冲液 (10X SSC或10X SSPE)进行过夜转膜。如果使用一种弱碱作为缓冲液(例如NorthernMax® 一小时转膜缓冲液),转膜可在一小时内完成。此外,您可以进行电印迹法,在1小时内对完成RNA的转膜。

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