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核酸染料

影响DNA条带在凝胶内迁移的因素有两个。

  1. 染料所带电荷。DNA在凝胶内迁移是因为它所带的负电荷导致其向阳极迁移。但是,与DNA结合的荧光染料其自身也带有电荷,能提高或者降低(大多数情况)DNA的迁移速率。
  2. 染料亲和力。 某些染料与DNA的亲和性很高从而引起迁移速率的显著改变。但是,大多数染料的亲和性处在某一个水平,导致该染料以一定的速度有效的与DNA结合和解离。电泳中出现的大多数问题正是这一原因导致的。如果染料从DNA解离而没有得到补充(例如因为在加样之前DNA和染料混合,凝胶内没有染料),那么当DNA迁移时,与其结合的染料将减少。这时,你通常会看到条带扩散并可能出现迁移模式的改变。这一效应通常对低分子量条带的影响更大,因为通常低分子量条带本身的质量更低,也就是说该条带内起始的总染料量更低。这就是为什么对于大多数SYBR®染料我们通常建议使用后染色,或者在制胶时加入染料,或者跑胶后使用SYBR® Safe DNA凝胶染料染色。有人发现在上样缓冲液中将SYBR®染料的浓度提高到10X(例如,对于通常的10,000X工作存储液进行1:1000稀释)可以降低上述效应。

很多衣服内的增白剂,以及某些真菌和细菌,和SYBR® Safe DNA凝胶染料会发出同样波长的荧光。这些位于凝胶表面或凝胶内的污染物可能会产生斑点。

核酸Ladder和Marker

如果marker被加热了,会出现这种情况。请确保DNA ladder在使用前没有被加热过。

这里是一些可能导致条带弥散的原因:

  • DNA被降解。请避免DNA标准品被核酸酶污染。
  • 凝胶内上样了过多的DNA。减少凝胶内的DNA量。
  • DNA被蛋白污染。电泳前使用苯酚抽提除去蛋白。
  • 对于小分子量DNA,条带可能会在染色时扩散。在电泳之前加入溴化乙锭(EB)。
  • 对于超螺旋的DNA Ladder,可能是EB的用量不足。确认样本中是否含有终浓度为10–50 μg/mL的EB。
  • 对于放射性标记的DNA,标记是使用切口平移进行的。使用T4 DNA聚合酶对DNA进行置换合成来标记,或者使用T4多核苷酸激酶进行5’末端标记。
  • 使用了不合适的电泳条件。电泳电压不能超过~20 V/cm,电泳时保持温度<30°C,检查电泳缓冲液是否具有足够的缓冲能力。
  • DNA含盐太多。电泳前使用乙醇沉淀去除过多的盐。

这一现象的出现有下列一些可能的原因:

  • 小分子量DNA条带电泳迁移到了凝胶以外。使用较短的电泳时间或较低的电泳电压,或者使用更高浓度的凝胶。
  • 由于凝胶和缓冲液之间的离子强度不同而导致小分子量条带随着染料的前沿迁移。确保凝胶内的缓冲液和电泳缓冲液是相同的。
  • 相似分子量的DNA条带没有被分开。延长电泳时间并检查是否使用了合适的凝胶浓度。对于小于1000bp的DNA片段,可用Agarose 1000 (货号: 16550100)替代琼脂糖。
  • DNA发生了变性。电泳前不要加热标准品(除非是lambda噬菌体来源的marker)。使用含有20 mM NaCl的缓冲液稀释marker。

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