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cDNA文库构建

RNA起始量较少可导致cDNA得率低。对于标准文库构建请使用0.5–5 µg起始mRNA,检验mRNA完整性,并使用RNA对照进行反应。尝试使用放射性标记实验方案评估cDNA合成反应的效率。我们也建议对转化效率和Gateway酶效率进行检测。

如果没有正确准备用于不同大小片段分离的柱子,也会导致cDNA得率低。在加入更多缓冲液前,应使柱子完全干燥,并应确保流速/液滴大小合适。

较小的平均插入片段大小可能是因为attB1接头污染、mRNA样品部分降解、片段分离存在问题和/或起始mRNA量不足。

检查一下BP重组中使用的cDNA量是否不足,因为这可能使得重组子比例较低。

当克隆含有较小的插入片段时,更有可能在相似的attL1和attL2位点之间形成一个发夹结构,从而容易发生上述情况。为了解决这一问题,请遵循以下建议:

  • 使用可制备高质量质粒DNA的试剂盒,如PureLink HiPure Plasmid Miniprep试剂盒。
  • 每个测序反应使用约700 ng的DNA。
  • 应确保克隆经BsrG I限制性内切酶酶切鉴定具有有效插入片段。如果克隆中没有插入片段,则限制性酶切分析只会显示2.4 kb的载体主条带。在这种情况下,空克隆的测序结果通常很差。
  • 尝试使用一套新的测序引物。
  • 可根据下述参考文献的描述,使用封闭oligo:Esposito D, Gillette WK, Hartley JL. (2003) Blocking oligonucleotides improve sequencing through inverted repeats.Biotechniques 35:914-920.
  • 对于特别难测序的克隆,您可通过LR转移反应将克隆转入选定的目标载体中。attB位点比attL位点小很多,因此更容易测通。

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