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腺病毒表达

以下为一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
使用不正确的抗生素来筛选转化子 在含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上筛选转化子。
未使用蛋白酶K处理LR重组反应体系 在转化前使用蛋白酶K处理LR重组反应体系。
在LR反应中使用了过多的入门克隆DNA 在LR反应中使用50-150 ng入门克隆DNA。
在LR反应中使用不当的入门克隆:DEST载体比例 入门克隆:DEST载体的摩尔比应为1:1。
对插入片段长于5 kb的LR重组反应体系只孵育1小时 对插入片段长度超过5 kb的片段,我们建议将LR反应体系孵育过夜。注意:过夜孵育也能提升小插入片段的克隆数目。
腺病毒Destination载体DNA发生了断裂 务必小心操作腺病毒Destination载体。不要进行过多可能造成DNA断裂的操作(如涡旋或剧烈吸打溶液)。
没有用推荐数量的LR Clonase® II酶混合物,或LR Clonase® II酶混合物已失活 -请确保将LR Clonase® II酶混合物保存于–20°C。
-请勿将LR Clonase® II酶混合物冻融超过10次。
-请使用推荐用量的LR Clonase® II酶混合物(参见使用手册第14页)。
-请尝试另一管分装的LR Clonase® II酶混合物产品。
转化时使用的LR反应体系不足 使用适当的大肠杆菌感受态菌株来转化2-3 μL LR反应体系。使用转化效率 >1 x 108 cfu/μg的大肠杆菌细胞。
使用不足量的转化混合物进行铺板 增加大肠杆菌的铺板用量。

以下为一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
将LR反应体系转化至包含F'游离体和ccdA基因的大肠杆菌菌株中 使用不含F'游离体的大肠杆菌菌株进行转化(如TOP10、DH5α-T1R)。
(完全或部分)删除腺病毒Destination载体中的ccdB基因 腺病毒Destination载体以溶液形式提供,可直接应用于LR反应。不过,如果您希望扩增这些载体,我们推荐您使用One Shot® ccdB Survival™ 2 T1R化学感受态细胞(货号A10460)。
-在含有50–100 μg/mL氨苄青霉素和15–30 μg/mL氯霉素的培养基中筛选转化子,以维持载体的完整性。
-从一个或多个克隆制备质粒DNA,并在使用前验证载体的完整性。

以下为一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
低转染效率:
-腺病毒Destination载体发生了断裂
-不彻底的Pac I消化效果或消化后的DNA含有苯酚、乙醇或盐类
-使用了不健康的293A细胞;细胞活力较低
-293A在转染前一天培养密度过低
-质粒DNA与转染试剂之间的比例错误

-小心操作腺病毒Destination载体。不要进行过多可能造成DNA断裂的操作(如涡旋或剧烈吸打溶液)。
-重新进行Pac I消化处理。请确保使用未含苯酚,乙醇或盐类的纯净DNA。


-使用健康的293A细胞;不要让细胞过度生长。

-转染时刻细胞(密度)应处于90-95%的融汇度。

-将质粒DNA(μg为单位):Lipofectamine® 2000(μL为单位)的比例设置为1:2到1:3。如果您正在使用另一款转染试剂,请按照生产商的推荐用法进行条件优化。
病毒上清液稀释过度 通过CsCl离心或任意可选方法对病毒进行浓缩处理。
病毒上清液经多次冻融 请勿将病毒上清液冻融超过10次。
目的基因过长 病毒滴度通常随着插入片段长度的增加而降低;不推荐使用超过6 kb(在pAd/CMV/V5-DEST™中)和7.5 kb(在pAd/PL-DEST™中)的插入片段。
目的基因对细胞有毒性 不推荐构建包含激活型致癌基因或潜在有害基因的载体。

以下为一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
病毒母液未正确储存。 分装并将母液保存于–80°C。请勿将其冻融超过10次。
使用错误的细胞系进行病毒滴度测定 请按照 手册第23页中所讨论的属性选择细胞系,或直接使用293A细胞系。
未正确制备琼脂糖覆层 请确保向细胞加入的琼脂糖不会过热;过热的琼脂糖将杀死细胞。
病毒储存液的滴度过低或过高 以更宽广的续列稀释度(以10倍为单位,如10-2至10-8)来测定腺病毒的滴度。

这可能由病毒上清液的稀释度不足所致。我们推荐您使用从10-4至10-9续列稀释度来检测腺病毒滴度。

以下为一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
病毒母液未正确储存。 分装并将母液保存于–80°C。请勿将其冻融超过10次。
目的基因中含有一个Pac I位点 进行突变操作,来改变或去除PacI位点。

以下为一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
低转导效率:
-哺乳动物细胞不够健康
-使用了非分裂型细胞

-请确保您用的细胞在转导前保持健康状态。
-以更高的MOI比例值向您的细胞中转导腺病毒。
MOI值过低 以更高的MOI比例向您用的细胞中转导腺病毒。
病毒滴度过低 使用手册第20页的步骤扩增腺病毒母液。
腺病毒母液受RCA(具有复制能力的腺病毒)污染 -筛查RCA污染。
-制备全新的腺病毒母液或噬菌斑纯化以分离重组的腺病毒。
转导操作后过早收获细胞 请至少在转导24小时之后收获细胞。
转导操作后过晚收获细胞 对于分裂活跃的细胞,请在转导5天内检测重组蛋白表达的最高水平。
目的基因对细胞有毒性 不推荐构建包含激活型致癌基因或潜在有害基因的载体。

以下为一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
使用了过量的原始病毒母液 -减少用于转导的原始病毒母液,或对原病毒母液进行稀释。
-Amplify the adenoviral stock.
-Concentrate the crude viral stock.
野生型RCA(具有复制能力的腺病毒)污染 筛查RCA污染。噬菌斑纯化以分离重组的腺病毒,或制备全新的腺病毒母液。
目的基因对细胞有毒性 不推荐构建包含激活型致癌基因或潜在有害基因的载体。

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