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概述

腺病毒表达通常适用于瞬时表达,而慢病毒表达一般用于长时间表达。腺病毒可在293A细胞中扩增数次,而浓缩慢病毒的方法一般只有离心。腺病毒需要宿主细胞表达CAR受体才能实现有效的转导,由于慢病毒颗粒上包被了VSVG膜蛋白,这些病毒能够适用于更广泛的哺乳动物细胞类型。

MOI(multiplicity of infection)是感染复数。理论上,MOI=1意味着平板中生长的每一个细胞被一个病毒颗粒所感染,MOI=10意味着每个细胞被10个病毒颗粒所感染。不过,许多因素都会影响最佳的MOI,如哺乳动物细胞系的天然属性,(分裂与不分裂细胞),转导效率,目的用途以及您的目的蛋白等。

当您第一次将构建的腺病毒或慢病毒转导进所选的哺乳动物细胞系中时,我们建议您尝试使用一系列MOI(0,0.5,1,2,5,10,50),以确定获得最佳基因表达效果所需的MOI值(使用慢病毒转导神经元时,我们一般使用超过50的MOI值——如MOI 100)。当您确定了获得最佳基因表达效果所需的MOI值后,后续的转导实验就都可应用这一优化的MOI值。

如果您希望实现稳定整合和进行筛选,请选择慢病毒系统。我们提供定向的TOPO(D-TOPO)和Gateway两种类型试剂盒,便于用户基因克隆操作的灵活性。如果您在寻找瞬时基因表达系统,请选择腺病毒系统。我们为此提供Gateway克隆方法。

不过还需要注意,这两种系统中的基因表达通常可在转导后24-48小时内进行检测,所以其实两种系统均可用于瞬时性质的实验。两者之间的主要区别在于慢病毒会整合于宿主细胞基因组中,而腺病毒不会。腺病毒能够获得更高的病毒滴度。

慢病毒表达系统 - 表达载体

慢病毒是慢作用逆转录病毒属的成员,其特点是潜伏期较长。

我们的慢病毒载体基于HIV-1骨架。不过,我们对此骨架进行了一些修改,使它们只作为基因转入载体而不会发生后续的病毒复制或导致疾病。我们删除了HIV-1特异性的基因以提升其安全性。HIV-1基因仅表达于生产细胞(293FT),而且不会被装入病毒基因组,因此不会在转导的靶向细胞中表达。

TOPO克隆方法是简单易用的5分钟PCR克隆法,我们基于此种技术开发了许多试剂盒。如果您只需构建一个载体,就可选择这一方法。如果您希望将目的基因克隆进多个不同的表达系统,可考虑Gateway克隆技术——这一技术也应用于我们推出的多个表达试剂盒。挑选克隆方法的另一个考量因素是插入序列的大小。如果您的插入序列>4kb,我们推荐您选择Gateway克隆法,对于长片段插入序列,TOPO克隆法的效率较低。

我们推荐用户在–20°C条件下储存慢病毒表达载体。由于它们相对较大,我们并不推荐在–80°C保存这些载体,因为在后一温度条件下,载体溶液将彻底冻结,–80°C条件下的过多次反复冻融将会影响克隆效率。

我们强烈建议使用Stbl3™大肠杆菌来克隆慢病毒载体。Stbl3™大肠杆菌的基因组中携带了recA13突变,能够帮助减少LTR之间发生不必要重组事件的可能性。在转化Stbl3™大肠杆菌之后,我们推荐用户挑取克隆并通过小量制备与使用Afl II和Xho I消化操作来对慢病毒DNA进行验证。我们所推出的全部慢病毒载体的5'和3’LTR中均含有Afl II位点,而MCS的3'端还有一个Xho I位点。假设Afl II仅在LTR位点中进行切割,而插入片段中不含Afl II或Xho I位点,则AfI II + Xho I消化预期会产生3段 DNA片段。任何非预期的DNA片段都将推定为LTR重组的结果。只有符合预期的DNA片段切割模式的克隆会被挑出,而进入后续的中量制备步骤。

我们不推荐使用小量制备试剂盒来制备慢病毒载体,因为慢病毒小量制备DNA的得率通常很低,这是由于载体骨架中存在的LTR所致。我们推荐用户使用S.N.A.P.™中量制备试剂盒(MidiPrep Kit,货号K191001)或PureLink HiPure质粒中量制备试剂盒(货号K210004)来制备慢病毒载体DNA,这两款试剂盒的重悬缓冲液中均包括10 mM EDTA。由于慢病毒DNA的中量制备通常得率也较低,我们推荐用户按照专用实验方案进行操作,以提高得率——简言之,缓慢培养细胞;每个抽提柱加入少量细胞;每次DNA中量制备使用100 mL慢病毒培养物。

注意:如果您希望在克隆操作/克隆筛选过程中通过小量制备慢病毒质粒,我们推荐您使用PureLink HQ小提试剂盒(Mini Kit,货号K210001),并按照说明书来开展实验,只是有一处需要优化:使用50 mL TE,pH 8.0缓冲液洗脱一次。通常情况下,此方法的得率很低:100–150 ng/mL(即一共获得5–7 mg)。其OD 260/280通常介于1.8和2.1之间。

可以,慢病毒表达载体自身可作为表达载体,通过适当的抗生素实现稳转筛选。请注意这一载体的大小大约是一般常用载体的两倍。因此,您可能需要增加载体的转染量,以获得近似的摩尔量水平。

HIV-1基因组由两条相同的单链RNA拷贝所组成。双链RNA在上述情况下可能会形成,由于dsRNA将干扰基因组的包装,会降低病毒滴度。因此,从LTR的反向插入表达阅读框将会降低病毒滴度。
参考文献:Mautino et al.(2000) Human Gene Therapy 11:895.

我们所推出的全部pLenti表达载体均含有2个poly(A)位点:一个poly(A)位于HIV-1来源的3'LTR中,一个SV40 poly(A)位于3'LTR的下游。包含两个poly(A)序列的原因是为了降低转录受干扰的几率(举例来说,如果这里有大量转录持续通过RSV启动子区域,就可能会对RSV启动子自身的转录过程造成潜在干扰,而后一转录过程对于病毒RNA的合成至关重要。一旦慢病毒整合进靶细胞,SV40 poly(A)就不存在了(由于病毒序列只从5'LTR延伸至3'LTR),但3'LTR区域内的poly(A)区域仍会存在并发挥功能。

我们提供C或N端带有Lumio™标签的慢病毒表达载体,这些载体是我们所推出表达系统的一部分,分别是货号K37020和货号K37120。这些载体可帮助用户在活细胞中方便地对蛋白进行检测和定位。

Lumio™标签非常小;只有6个氨基酸(600 Da左右),而GFP标签平均在27 kDa左右。由于慢病毒滴度在融合基因>6 kb的条件下会发生显著下降,带有Lumio™小标签的慢病毒表达载体就能够有助于用户插入更大的目的基因(GOI)。如果使用GFP标签,留给GOI的长度就减少了719 bp的长度。这是EmGFP的碱基对长度(bp)。此外,带Lumio™-标签的慢病毒载体能够帮助用户方便地在活细胞中对蛋白进行检测和定位。

我们提供Vivid Colors™ pLenti6.3/V5-GW/EmGFP表达对照载体(货号V37006)和Vivid Colors™ pLenti6.2-GW/EmGFP表达对照载体(货号V36920),这两种产品均为包含祖母绿荧光蛋白(EmGFP)的慢病毒载体。它们针对ViraPower™慢病毒表达系统中的阳性对照品应用进行了专门设计,在转染293FT细胞之后用户可实现EmGFP荧光的检测。这些载体可作为滴度对照品,生成表达EmGFP的慢病毒,也可在分裂与非分裂的哺乳动物细胞的转导过程中作为转导对照品。这两类载体都不是克隆载体。Vivid Colors™ pLenti6.3/V5-GW/EmGFP表达对照载体拥有能够驱动EmGFP持续表达的CMV启动子,以及驱动杀稻瘟菌素——稳转筛选标志物长期、持续表达的PGK启动子,而Vivid Colors™ pLenti6.2-GW/EmGFP表达对照载体则拥有驱动EmGFP持续表达的CMV启动子和驱动杀稻瘟菌素——稳转筛选标志物表达的SV40启动子。此外,Vivid Colors™ pLenti6.3/V5-GW/EmGFP表达对照载体是一种HiPerform™载体,这意味着它包含有两种关键的遗传元件:旱獭转录后调控元件(WPRE)和源自HIV-1整合酶基因的中央多聚嘌呤区(cPPT)序列,进而能够在大多数类型的细胞中将蛋白表达水平提升4倍以上(相比不含这些元件的慢病毒载体而言)。

完整的试剂盒组成信息列举于产品手册中的“试剂盒内容与保存方式”部分中。请在我们的网站(www.lifetechnologies.com)使用货号进行搜索,以查寻您感兴趣的产品。一旦进入产品页面,您就可使用手册链接来浏览和下载产品手册了。我们提供各类载体/试剂盒来满足不同研究者多种多样的克隆和表达策略的需要。

在pLenti6载体中,杀稻瘟菌素(Bsd)抗性标志物基因由SV40启动子来启动;而在pLenti6.2载体中,Bsd抗性标志物则由磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子所启动。

这一差别在操作干细胞的过程中变得至关重要;PGK启动子为天然的哺乳动物启动子,能够耐受沉默效应并在干细胞中表现出长期的持续表达,而SV40启动子通常在原代细胞和干细胞中会随着时间推移而被逐渐沉默。

插入慢病毒载体中的片段不应含有poly(A)信号。天然的poly(A)信号(AATAAA或类似序列)会在使用Oligo dT进行cDNA合成的过程中被扩增。因此,它将成为cDNA文库或其克隆的一部分。

由于慢病毒是一种RNA病毒,而RNA基因组在合成过程中还会被包装起来,如果插入序列中含有多聚腺苷酸(poly(A))信号,则RNA将会被过早终止。载体中包含了一个SV40 poly(A)信号,但这一信号位于第二LTR序列的下游,它的设计也应如此。几乎任何源自Gateway cDNA文库的克隆都很可能含有poly(A)信号,该信号一旦插入慢病毒载体中,就会造成病毒RNA的提前终止。

为了避免慢病毒RNA提前终止的情况发生,请考虑以下建议:

  • 应先从文库中挑选出所需基因,将其克隆至不含poly(A)信号的入门载体——如pENTR/D-TOPO——之中(即从起始密码子ATG至终止密码子),之后再克隆至慢病毒载体中。
  • 如果您试图建立一个慢病毒表达文库,您可能需要使用随机六聚体而非oligo dT来建立的文库,因为这样的文库的插入序列中将不太可能含有poly(A)信号。

插入片段的大小通常不是问题。慢病毒插入片段的大小限制为5-6kb左右(SuperScript II预制文库的平均插入片段大小为1.5 kb左右)。

这些系统之间的主要区别在于试剂盒中所包含的慢病毒表达载体。ViraPower™慢病毒表达载体的骨架与ViraPower™ HiPerform™慢病毒表达载体的骨架相似,只是后者加入了两个新元件:目的基因下游直接连接了一段源自旱獭肝炎病毒的WPRE(旱獭转录后调控元件)序列,该序列有助于提升转基因的表达水平;源自HIV-1整合酶基因的cPPT(中央多聚嘌呤区)序列能够增加慢病毒整合进宿主基因组的拷贝数,进而能提高病毒滴度达两倍左右。总之,相比不含WPRE和cPPT元件的ViraPower™慢病毒表达系统而言,这些元件能够在大多数类型的细胞中将蛋白表达效率提升四倍以上。在ViraPower™ HiPerform™ Fast Titer™表达系统中,不仅含有WPRE和cPPT元件,慢病毒表达载体中以EmGFP报告基因代替了Bsd基因,这样转导后仅需两天用户就可通过流式细胞术对活性病毒的滴度进行检测。

在ViraPower™ HiPerform™慢病毒FastTiter™表达系统中,慢病毒表达载体中包含了WPRE和cPPT元件。此外,这些载体的骨架中还以EmGFP报告基因替代了Bsd,这样用户就可在转导后仅两天的时间点凭借流式细胞术来对功能性病毒进行滴度测定。

注意:FastTiter™表达试剂盒专为通过流式细胞术快速筛选瞬转细胞的应用而进行了优化。在这款试剂盒的使用过程中,尽管表达目的基因的细胞数量相比其他不含WPRE和cPPT元件的pLenti载体显著提高,但EmGFP的荧光信号强度并未针对使用荧光显微镜的检测进行优化。因此,我们推荐用户使用流式细胞术来检测转导细胞中的EmGFP荧光。

我们提供了将ViraPower™ HiPerform™慢病毒与T-REx™技术整合在一起的ViraPower™ HiPerform™ T-REx™ Gateway表达系统(货号A11141),本试剂盒用于在分裂或非分裂型哺乳动物细胞中提升慢病毒介导的目的基因的调控性高表达。ViraPower™ HiPerform™ T-REx™ Gateway载体试剂盒可单独购买(货号A11144)。如需获得T-REx™系统相关的更多详情,请参见 哺乳动物表达支持

 

可行,您可使用我们的一株T-REx™细胞系作为pLenti6.3/TO/V5-DEST慢病毒载体的表达宿主。不过,请注意pLenti6.3/TO/V5-DEST载体是一款包含WPRE和cPPT元件的HiPerform™慢病毒载体,能够提升病毒滴度和表达水平;而我们所提供的T-REx™细胞系则不含这些遗传元件。此外,您使用这些T-REx™细胞系仅能用于瞬时表达,因为 Lenti6.3/TO/V5-DEST慢病毒表达质粒和Tet抑制子质粒(pcDNA™6/TR)均能够稳定整合进T-REx™细胞中,而这两者又都含有杀稻瘟素筛选标志物,因此建立稳转细胞系的操作就无法实现。

我们提供ViraPower™ HiPerform™ 无启动子(Promoterless)Gateway表达系统(货号A11145),该产品整合了ViraPower™ HiPerform™ 慢病毒技术和MultiSite Gateway技术,能够为用户提供便利的重组克隆操作和目的基因高水平的慢病毒表达,适用于分裂与非分裂哺乳动物细胞,并可由用户自己选择任意类型的启动子。ViraPower™ HiPerform™ Promoterless Gateway载体试剂盒可单独购买(货号A11146)。

我们的慢病毒表达载体中约包含20%的原始病毒基因组。出于使用安全性的考虑,其余的病毒基因组已从我们的慢病毒表达载体中删除了。

我们的慢病毒表达载体属于第三代,这意味着我们使用了由4个质粒构成的载体系统(1个慢病毒表达载体和3个包装质粒),因此消除了重组事件将各个元件重组在一起形成单一载体从而产生可复制慢病毒的风险。此外,这些载体还包含嵌合型的5'LTR,这样病毒的生成就摆脱了对HIV tat反式激活因子的依赖。同时,LTR(长末端重复)中原始的U3区也被删除,从而形成自失活病毒而不能再复制。

我们的慢病毒包装混合系统属于第三代产品,这意味着其中不表达tat基因。而且,gag/pol和rev基因也都做为独立的质粒进行提供,因此消除了重组事件将各个元件重组在一起形成单一载体从而产生可复制慢病毒的风险。

我们的慢病毒表达载体属于第三代产品,这意味着其中包含了嵌合型的5'LTR——这样病毒的生成就摆脱了对HIV tat反式激活因子的依赖。其结果是,它们能够兼容第二代或第三代的包装混合系统。

您的第二代慢病毒载体无法与我们提供的包装系统兼容,因为我们的包装系统属于第三代产品,这意味着其中不含tat基因;而你的慢病毒载体需要tat基因参与才能形成病毒。

我们的慢病毒包装系统属于第三代产品,这意味着其中不含有tat基因。如果慢病毒载体属于第三代乃至更新的产品,则病毒生成过程就不依赖于tat基因的参与。

慢病毒表达系统 - 病毒生产

ViraPower™ 慢病毒包装混合系统是三种病毒包装质粒——pLP1、pLP2和pLP VSVG的优化混合物,以1 mg/mL浓度 的TE缓冲液(pH8.0)形式进行供货。这些质粒不提供单品销售。

野生型HIV-1基因组的大小在10 kb左右。由于源自pLenti载体的表达所需元件加在一起约有4-4.4 kb,因此目的基因的大小理论上不应超过5.6-6kb,才能有效实现病毒包装过程。病毒滴度通常随着插入片段长度的增加而减小。

“F”意味着这一特定的293细胞克隆(称为293F)能够实现高转染效率,“T”表示SV40大T抗原。大T抗原表达质粒已稳定整合进基因组中,并赋予这些细胞对Geneticin抗生素的抗性。SV40大T抗原的存在对于慢病毒高滴度的生成十分重要,其确切机理尚不十分清楚。使用通用型293细胞或其他的293T细胞系来生成病毒是可行的,不过您获得的病毒滴度可能会比较低。

我们使用经测试不含支原体的Gibco FBS(货号 16000-044)。我们发现,如果按照产品手册中的说明以这款FBS培养293FT细胞时,病毒生成效率要比使用其他来源的血清更高。我们使用以下塑料器皿来培养293FT细胞:

T175—Fisher 货号 10-126-13;这是一款Falcon培养瓶,带有0.2 μm透气塞的密封盖。

T75—Fisher 货号 07-200-68;这是一款Costar培养瓶,带有0.2 μm透气塞的密封盖。

100 mm 平板—Fisher 货号 08-772E;这是一款针对组织培养应用进行预先处理的的Falcon聚苯乙烯平板。

在常规细胞培育条件下,我们应用这些平板获得了绝佳的细胞粘附效果。

293FT细胞系稳定表达源自pCMVSPORT6Tag.neo质粒的SV40大T抗原,该载体中同时也包含了新霉素抗性标志物。为了保持质粒的存在和表型的正常,细胞需要常规培养于含有500 μg/mL浓度Geneticin(G418)抗性的培养基中。

合胞体是由相邻的293FT细胞通过VSV-G诱导的融合效应所形成的大型多核细胞。合胞体的产生是获得高转染效率和慢病毒生成效果的一个表征。不过请记得,未产生合胞体并不意味着病毒没有生成。请参见下图中在转染GFP慢病毒表达载体后由293FT细胞形成的合胞体。 

如果转染后不久(4小时至过夜)293FT细胞就从平板上脱离下来:

  • 这可能是Lipofectamine 2000的毒性所致。可能在转染前细胞种植密度过低。
  • 用户对这些细胞的操作可能不够轻柔(这些细胞有易于漂浮的倾向)。
  • 这些细胞可能在室温条件下放置时间过长。

如果在转染48-72小时的时间段内细胞脱离:

  • 如果细胞大片脱离,这可能是慢病毒产生的一个标志。

我们推荐您立即将所生成的慢病毒母液分装为小体积工作液,之后在–80°C条件下长期保存。慢病毒对于储存温度和冻融操作很敏感,因此需小心操作。每一次冻融都将损失多达5%乃至更多的病毒活性。如保存良好,合适滴度的病毒储存液可保存一年。经长期保存后,我们推荐您在使用前重新测定病毒储存液的滴度。

使用我们的慢病毒系统产生的是复制缺陷型慢病毒,这是其具有的一个安全特性。如需更多病毒,您必须执行一次全新的转染操作。

是的,我们的确提供慢病毒生产的定制服务。请向techsupport@lifetech.com发送相关邮件,以了解更多详情。

慢病毒表达系统 - 病毒滴度测定

我们强烈推荐您使用人纤维瘤细胞系HT1080(ATCC,货号CCL-121)作为慢病毒滴度测定的一个“金标准”。一个主要的原因是该细胞系的转导效率很高,因此所获得的滴度测试结果也很精准稳定。不过,您可能也需要在开展表达实验之前,使用相同的哺乳动物细胞系来测定您的慢病毒储存液。通常情况下,这些细胞应该是非迁移性的贴壁细胞系,倍增时间在18-25小时左右。普通型293细胞也可用于慢病毒的滴度测定,但我们不推荐使用293T或293FT细胞,因为这些细胞中含有SV40大T抗原——在整合的慢病毒表达载体中含有SV40复制起点,它可能会介导不需要的DNA复制。这种DNA复制作用通常会导致细胞死亡或很低的滴度。慢病毒属于慢逆转录病毒属,特点是潜伏期长。

您可使用p24 ELISA分析法来检测慢病毒滴度,但请切记,通过这一方法测得的病毒滴度并非功能性病毒特异性的滴度,因为非活性病毒和活性病毒都将被这一方法检测出来。其结果是,使用这一方法测得的病毒滴度通常比用杀稻瘟菌素筛选等方法测得的功能性病毒滴度高10倍以上。

您可通过针对病毒基因的PCR/qPCR分析法来检测慢病毒滴度,但请切记,通过这一方法测得的病毒滴度并非功能性病毒特异性的滴度,因为非活性病毒和活性病毒都将被这一方法检测出来。其结果是,使用这一方法测得的病毒滴度通常比用杀稻瘟菌素筛选等方法测得的功能性病毒滴度高10倍以上。

慢病毒表达系统 - 转导与分析

慢病毒包膜是由水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-G)包被的,这样慢病毒和靶细胞之间就能够以不依赖受体的方式完成相互作用。其结果是,慢病毒就拥有了更广泛的兼容性,进而在理论上适用于任何类型哺乳动物细胞的转导操作。这一不依赖受体而进入靶细胞的过程类似于内吞作用(Espenshade et al.(2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99:11694; Aiken (1997) J Virol 71:5871)。

我们通过研究发现,以大约MOI=1进行慢病毒转导,通常情况下在活跃分裂的细胞系(如HT 1080)中有80-90%成功表达了靶基因。一些非分裂型细胞转导慢病毒的效率较低。举例来说,以大约MOI=1进行转导,人原代成纤维细胞表达靶基因的效率只有50%左右。如果需要向非分裂型细胞中转导慢病毒,您可能需要增加MOI值(如MOI=10)来获得更好的重组蛋白表达水平。如果您首次使用慢病毒转导哺乳动物细胞,我们推荐您尝试一个MOI范围(如0,0.5,1,2,5,10),以帮助在您的应用中确定获得最佳蛋白表达效果所需的MOI值。

Polybrene试剂(海地美溴铵)是Sigma-Aldrich提供的阳离子聚合物(货号H9268),能通过中和病毒颗粒与细胞表面之间的电荷斥力来增强转导效率。为了获得最佳结果,我们推荐用户在含有Polybrene试剂的条件下开展转导操作。不过请注意,某些细胞对Polybrene试剂(如原代神经元)比较敏感。因此,在开展转导实验之前,您可能要测试细胞系对Polybrene试剂(0–10 μg/mL)的敏感性;如果细胞表现出毒性效应或表型改变,则应避免使用Polybrene试剂。

注意:这些基于HIV的性质。

形态:病毒颗粒具有复杂的结构,具体由一层包膜,一层核衣壳,一个拟核和一个基质蛋白所组成。病毒颗粒被包膜所包裹,具有球形至多形的形态,直径在80-100 nm。病毒颗粒的表面密集和均匀地覆盖着不明显的小尖峰。表面突起有8 nm长。病毒颗粒核心为棒状或截短的锥形。具有同轴的拟核。

物化与物理性质:病毒颗粒在蔗糖中的浮力密度为1.13–1.18 g cm–3。病毒颗粒对于热、去垢剂和甲醛等处理敏感。其感染性不受辐照影响。

蛋白:蛋白成份占整个粒子质量的60%左右。病毒基因组编码了结构型蛋白与非结构型蛋白。病毒颗粒由5种主要的结构型蛋白和3种非结构型蛋白所组成。病毒基因组编码了一个RNA依赖的DNA聚合酶。

脂类:包膜中存在着脂类。脂质成份占整个粒子质量的35%左右。病毒脂质的组成与宿主细胞膜的组成类似。脂类来源于宿主的细胞膜。

碳水化合物:病毒颗粒约3%的质量来源于碳水化合物。

将慢病毒更久保留在细胞培养体系中的顾虑在于潜在的细胞毒性或影响生长。如果您绝对不能从细胞中去除病毒,我们则建议您将其留在培养体系中,并根据经验对细胞状态进行监控。

慢病毒表达系统 - 生物安全特性

The proviral construct, which is the viral DNA transfected into 293FT cells, looks like this: 
U3/R/U5---vector backbone---gene of interest---deleted U3/R/U5 

In our pLenti expression vectors, the wild-type U3 at the 5'LTR has been replaced with the RSV promoter. When RNA transcripts are made in 293FT cells, you will get two RNA molecules. One RNA will just be from the CMV promoter or any other promoter that is on the vector backbone. A second RNA transcript will be made from the RSV promoter and will look like this: 
R/U5---vector backbone---gene of interest---deleted U3/R 

The above RNA transcript made from the RSV promoter contains the viral packaging signal, but not the 5' U3 region. The CMV promoter is located downstream of the packaging signal. Therefore, the transcript from the CMV promoter will lack a packaging signal and will not be packaged into viral particles. Recall that the U3 region is where the wild-type viral promoter would normally be. 

When the packaged viral RNA gets into the target cell, it is reverse transcribed. During reverse transcription, the U3 at the 3'LTR is used as a template to generate the 5'LTR. Thus, after reverse transcription, the proviral DNA will look like this: 
deleted U3/R/U5---vector backbone---gene of interest---deleted U3/R/U5 

Note there is no RSV promoter at the 5'LTR, because it was lost during viral RNA production, as explained above. Also notice the deleted U3 region is now at the 5'LTR, which means there are no promoter functions in the 5'LTR. Thus, when this proviral DNA integrates into the target cell's genome, the only active promoters will be the ones provided by the vector backbone. 

Usually, our lentiviral vectors have two active promoters, a CMV and a SV40 promoter. The RNA transcript made from the CMV promoter will be quite long, and will include the gene of interest, the SV40 sequence, and the antibiotic-resistance gene. There is no transcription stop codon in front of the SV40 promoter. A second RNA transcript will be made from the SV40 promoter and will only code for the antibiotic resistance. The poly(A) tailing of these two RNA molecules is performed by the poly(A) signal located in the R region of the 3'LTR.

通过我们所提供的慢病毒系统产生的慢病毒不携带或表达任何病毒基因,因此没有相关的毒性问题。只有LTR位点之间的蛋白编码区会整合进入哺乳动物细胞染色体并实现表达。由于这些慢病毒内部的安全特性设计,其自身不会发生复制。

ViraPower™ 慢病毒表达系统在提升生物安全性方面,设计了以下特性:

  • pLenti表达载体的3'LTR中被删去了一段序列(ΔU3),这不会影响生产细胞系中病毒基因组的形成,但会在靶细胞转导后形成慢病毒的“自失活”效应(参考文献:Yee JK, Moores JC, Jolly DJ, Wolff JA, Respess JG, Friedmann T (1987) Gene Expression from Transcriptionally Disabled Retroviral Vectors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5197-5201; Yu SF, Ruden Tv, Kantoff PW, Garber C, Seiberg M, Ruther U, Anderson WF, Wagner EF, Gilboa E (1986) Self-Inactivating Retroviral Vectors Designed for Transfer of Whole Genes into Mammalian Cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:3194-3198; Zufferey R, Dull T, Mandel RJ, Bukovsky A, Quiroz D, Naldini L, Trono D (1998) Selfinactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient in vivo Gene Delivery.J. Virol.72:9873-9880).一旦整合进转导的靶细胞,慢病毒基因组就不再能产生可包装的病毒基因组了。
  • 本系统所采用HIV-1的基因数目被减至三个(即gag,pol和rev)。
  • 同时使用源自水泡性口膜炎病毒的VSV-G基因代替了HIV-1的包膜(参考文献:Burns JC, Friedmann T, Driever W, Burrascano M, Yee JK (1993) Vesicular Stomatitis Virus G Glycoprotein Pseudotyped Retroviral Vectors:Concentration to a Very High Titer and Efficient Gene Transfer into Mammalian and Nonmammalian Cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037; Emi N, Friedmann T, Yee JK (1991) Pseudotype Formation of Murine Leukemia Virus with the G Protein of Vesicular Stomatitis Virus.J. Virol.65:1202-1207; Yee JK, Miyanohara A, LaPorte P, Bouic K, Burns JC, Friedmann T (1994) A General Method for the Generation of High-Titer, Pantropic Retroviral Vectors:Highly Efficient Infection of Primary Hepatocytes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9564-9568).
  • 编码结构及病毒基因组包装所需其它元件的基因被分别独立插入四个质粒中。所有这四个质粒之间经设计,均不含任何同源序列,以避免相互之间发生不良的重组事件而形成具有复制能力的病毒(参考文献:Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyen M, Trono D, Naldini L (1998) A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System.J. Virol.72:8463-8471).
  • 尽管三种包装质粒能够在293FT细胞中反向表达生成子代病毒所需的蛋白(如gal,pol,rev,env),但它们都不含有LTR或Ψ包装序列。这意味着包装后的病毒基因组中实际上不会含有任何HIV-1的结构基因,因此,也不会在转导后的靶细胞中表达。转导后的细胞将无法生成具有复制能力的新病毒。
  • 本系统所生成的慢病毒颗粒不能自主复制,仅携带目的基因序列。本系统也不会生成其它类型的病毒。
  • 由于gag/pol mRNA转录本中HIV-1的RRE序列,pLP1中gag与pol基因的表达是Rev依赖性的。添加RRE序列能够避免在Rev不存在的情况下发生gag与pol的表达(参考文献:Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyen M, Trono D, Naldini L (1998) A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System.J. Virol.72:8463-8471).
  • 在pLenti表达载体中,组成型启动子(RSV启动子)位于5'LTR的上游,以补偿病毒RNA的有效形成过程对tat的依赖(参考文献:Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyen M, Trono D, Naldini L (1998) A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System.J. Virol.72:8463-8471).

尽管有以上安全特性方面的设计,所生成的慢病毒仍具有某些生物危害方面的风险,因为它们仍具有转导人体原代细胞的能力。基于此种原因,我们强烈建议您按照二级生物安全(BL-2)标准来操作本系统生成的慢病毒液,并严格遵守全部已发表的BL-2准则。此外,在生成包含潜在有毒或有害基因(如激活型致癌基因)的慢病毒过程中,用户应格外小心。

如需了解更多关于BL-2准则以及慢病毒操作的详细信息,请参见由疾病控制中心(CDC)出版的文件《微生物学与生物医学实验室的生物安全(Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories)》第四版(www.cdc.gov/biosafety/publications/index.htm)。

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