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我们强烈建议使用Stbl3™大肠杆菌来克隆慢病毒载体。Stbl3™大肠杆菌的基因组中携带了recA13突变,能够帮助减少LTR之间发生不必要重组事件的可能性。在转化Stbl3™大肠杆菌之后,我们推荐用户挑取克隆并通过Afl II和Xho I消化和和小量制备操作来对慢病毒DNA进行验证。我们所推出的全部慢病毒载体的5'和3’LTR中均含有Afl II位点,而MCS的3'端还有一个Xho I位点。假设Afl II仅在LTR位点中进行切割,而插入片段中不含Afl II或Xho I位点,则AfI II + Xho I消化预期会产生3段 DNA片段。任何非预期的DNA片段都将推定为LTR重组的结果。只有符合预期的DNA片段切割模式的克隆会被挑出,而进入后续的中量制备步骤。

通过小量制备获得慢病毒DNA的得率一般非常低,这是由于载体骨架中存在着LTR序列的缘故。因此,我们不推荐通过小量制备试剂盒来提取慢病毒质粒。我们推荐用户使用S.N.A.P.TM中量制备试剂盒(MidiPrep Kit,货号K191001)或PureLink HiPure质粒中量制备试剂盒(货号K210004)来制备慢病毒载体DNA,这两款试剂盒的重悬缓冲液(Resuspension Buffer)中均包括10 mM EDTA。由于慢病毒DNA的中量制备通常得率也较低,我们推荐用户依照专用实验方案进行操作,以提高得率——简言之,慢速培养细胞、每个抽提提柱加入少量细胞、每次DNA中量制备使用100 mL慢病毒培养物。

注意:如果您希望在克隆操作/克隆筛选过程中小量制备慢病毒质粒,我们推荐您使用PureLink HQ小型试剂盒(Mini Kit,货号K210001),并按照说明书来开展实验,只有一处需要优化:使用50 mL TE,pH 8.0缓冲液洗脱一次。通过该方法获得的DNA得率一般极低——100–150 ng/mL(即一共5–7 mg)。其OD 260/280的通常介于1.8和2.1。

如果转染后不久(4小时至过夜)293FT细胞就从平板上脱离下来:

  • 这可能是Lipofectamine 2000的毒性所致。可能在转染前细胞种植密度过低。
  • 用户对这些细胞的操作可能不够轻柔(这些细胞会有易于漂浮的倾向)。 
  • 这些细胞可能在室温条件下放置时间过长。

如果在转染48-72小时内细胞脱离:

  • 如果细胞大片脱离,这可能是慢病毒产生的一个标志。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
低转染效率:
  • 使用低品质的表达质粒DNA(即通过小量制备获得的质粒DNA)
  • 不健康的293FT细胞;低活力的细胞
  • 在含有抗生素(即Geneticin)的培养基中进行细胞转染
  • 使用了错误的质粒DNA:转染试剂比率
  • 293FT细胞的种植密度过稀
 
  • 请勿使用小量制备的质粒DNA进行转染。请使用PureLink HiPure质粒中量制备试剂盒(Plasmid Midiprep Kit)或CsCl密度梯度离心法来制备质粒DNA。



  • 使用16次传代以内的健康293FT细胞;请勿让细胞过度生长。使用至少经3-4代培养的细胞进行转染实验。

  • 尽管Geneticin对于293FT细胞的稳定维持是必需的,但转染过程中请勿向培养基加入Geneticin,它会降低转染效率并导致细胞死亡。



  • 使用1:2-1:3(μg:μL)的DNA:Lipofectamine 2000比例。


  • 以适当的密度种植细胞,使转染时间点的细胞融汇度达到90-95%,或使用反向转染方案(即将细胞加入含DNA-脂质体复合物的培养基中)。
转染的细胞没有培养于含有丙酮酸钠的培养基中。 培养一天后,吸去含有DNA-脂质体复合物的培养基,换成含有丙酮酸钠的培养基。丙酮酸钠能够为细胞提供额外的能量来源。
过早收获病毒上清液 通常在转染48-72小时后收集病毒上清液。如果在此时间点许多细胞仍粘附于平板并十分健康,则应等待24小时后再收获病毒上清液。收获病毒上清液的时间不应晚于转染后的72小时。
病毒上清液稀释过度 通过CsCl离心或任意可选方法对病毒进行浓缩处理。
病毒上清液经多次冻融 请勿将病毒上清液冻融超过3次。
目的基因过长 病毒滴度通常随着插入片段长度的增加而降低;不推荐插入片段长于5.6 kb。
目的基因对细胞有毒性 不推荐构建包含激活型致癌基因或潜在有害基因的载体。
DNA表达质粒中的LTR区域发生重排
  • 请确保使用Stbl3™细胞进行慢病毒质粒的转化
  • 使用Afl II与Xho I内切酶的组合,来对慢病毒质粒DNA进行限制性酶切。两段LTR序列中均含有Afl II位点。Xho I位点存在于插入片段3'端的质粒骨架中。假设插入片段中不含Afl II或Xho I位点,则AfI II + Xho I消化预期会产生3段 DNA片段。任何非预期的DNA片段都将推定为LTR重组的结果。
选择不适当的细胞系开展病毒滴度测定 应使用HT1080细胞或其他拥有手册中所讨论属性的粘附细胞。
转导过程中未加入Polybrene试剂 在Polybrene试剂存在的条件下向细胞中转导慢病毒。
Lipofectamine 2000操作不当
  • 4°C条件下保存。请勿冻存。
  • 在使用前通过倒转反应管来温和地进行混匀。请勿涡旋。
应用荧光显微镜来检查HiPerform™ FastTiter™慢病毒的滴度 HiPerform™ FastTiter™慢病毒载体转染细胞所获得EmGFP信号的水平未针对荧光显微镜进行专门优化。我们推荐用户仅通过流式细胞术来评估转导效率。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
使用过多的抗生素进行筛选 通过一组杀伤曲线实验来确定细胞系敏感的抗生素,并使用能够杀灭未转导细胞系的最低浓度。
病毒母液未正确储存 分装并将母液保存于–80°C下的冻存管中。请勿将其冻融超过3次。
转导过程中未加入Polybrene试剂 在Polybrene试剂存在的条件下向细胞中转导慢病毒。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
使用过少的抗生素进行筛选 增加抗生素用量。
在长满的细胞上进行筛选操作 加入筛选培养基之前,对转导细胞进行胰酶消化,并将其重新种植在更大的组织培养板中
病毒上清液未经充分稀释 以更宽的稀释度(以10倍为单位,如10-2至10-8)来测定慢病毒的滴度。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
启动子被沉默 CMV启动子有被沉默的倾向,特别是在小鼠或大鼠细胞中。筛选多个耐受抗生素的细胞克隆,并挑选其中表达水平最高的一个。为避免使用CMV启动子,您可使用无启动子的慢病毒载体,并换用如EF1alpha的启动子。
病毒母液未正确储存 分装并将母液保存于–80°C。请勿将其冻融超过3次。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
低转导效率:
  • 转导过程中未应用Polybrene试剂
  • 使用了非分裂型的细胞
 
  • 在Polybrene试剂存在的条件下向细胞中转导慢病毒。



  • 以更高的MOI向您的细胞中转导慢病毒。
MOI值过低 以更高的MOI向您的细胞中转导慢病毒。
使用过多的抗生素进行筛选 通过开展杀伤曲线分析来确定您所用细胞系的抗生素敏感性。使用能够有效杀灭未转导细胞系的最低抗生素浓度。
转导操作后过早应用抗生素 至少在转导48-72小时之后再加入抗生素进行筛选。
转导操作后过早收获细胞 至少在转导后48-72小时后再收获细胞——以让表达的蛋白在转导的细胞中富集。
目的基因对细胞有毒性 不推荐构建包含激活型致癌基因或潜在有害基因的载体。
DNA表达质粒中的LTR区域发生重排 使用AfI II与Xho I的组合酶进行限制性酶切。两端的LTR中均含有Afl II位点。Xho I位点存在于插入片段3'端的质粒骨架中。假设插入片段中不含Afl II或Xho I位点,则AfI II + Xho I消化预期会产生3段 DNA片段。任何非预期的DNA片段都将推定为LTR重组的结果。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
用于转导操作的病毒上清液体积过大
  • 吸去含有病毒的培养基,换以新鲜的完全培养基。
  • 浓缩病毒。
细胞对Polybrene试剂敏感 验证您所用细胞对Polybrene试剂的敏感性。如果细胞对其敏感,请在转导过程中省去Polybrene试剂的处理步骤。如果Polybrene试剂对您所用特异性的细胞类型有毒,则可将6–10 μg/mL的DEAE葡聚糖作为一种替代品。针对您所用细胞类型进行Polybrene试剂或DEAE葡聚糖的条件优化,对于成功的转导实验十分必要。
使用过多的抗生素进行筛选 通过开展杀伤曲线分析来确定您所用细胞系的抗生素敏感性。使用能够有效杀灭未转导细胞系的最低抗生素浓度。
转导操作后过早应用抗生素 至少在转导48-72小时之后再加入抗生素进行筛选。
目的基因对细胞有毒性
  • 不推荐构建包含激活型致癌基因或潜在有害基因的载体。
  • 尝试换用另一细胞系。
  • 以较低的MOI值进行转导。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
在荧光显微镜下使用了错误的滤镜组来观察细胞培养物,或流式细胞仪上的检测参数错误 请确保在倒置荧光显微镜上使用FITC或Omega XF100滤镜组(参见 手册第7页)或在您的流式细胞仪中准确应用FITC检测参数。
病毒母液未正确储存 分装并将母液保存于–80°C下的冻存管中。请勿将其冻融超过3次。
转导过程中未加入Polybrene试剂 在Polybrene试剂存在的条件下向细胞中转导pLenti6.2-GW/EmGFP。
EmGFP表达时间过短以致难以观察 如需获得最佳的EmGFP表达水平,请在转导4天后进行观察。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
低转导效率:
  • 转导过程中未加入Polybrene试剂
  • 使用了非分裂型的细胞
 
  • 在Polybrene试剂存在的条件下向细胞中转导pLenti6.2-GW/EmGFP。

  • 以更高的MOI值向您的细胞中转导pLenti6.2-GW/EmGFP。
MOI值过低 以更高的MOI值向您的细胞中转导pLenti6.2-GW/EmGFP。
转导操作后过早收获细胞 至少在转导后48-72小时后再收获细胞——以让转导细胞中EmGFP表达和富集。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
启动子被沉默 pLenti6.2-GW/EmGFP可能整合到某一染色体区域,进而造成CMV启动子(控制着EmGFP)的沉默。筛选多个耐受抗生素的细胞克隆,并挑选其中表达水平最高的一个。
在荧光显微镜下使用了错误的滤镜组来观察细胞培养物,或流式细胞仪上的检测参数错误 请确保在倒置荧光显微镜上使用FITC或Omega XF100滤镜组(参见 手册第7页)或在您的流式细胞仪中准确应用FITC检测参数。

这可能是由于在筛选过程中应用了过量的杀稻瘟菌素所致。通过开展杀伤曲线分析来确定您所用细胞系的抗生素敏感性。使用能够有效杀灭未转导细胞系的最低抗生素浓度。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
在荧光显微镜下使用了错误的滤镜组来观察细胞培养物,或流式细胞仪上的检测参数错误 请确保在倒置荧光显微镜上使用FITC或Omega XF100滤镜组(参见 手册第7页)或在您的流式细胞仪上准确应用的FITC检测参数。
病毒母液未正确储存 分装并将母液保存于–80°C下的冻存管中。请勿将其冻融超过3次。
转导过程中未加入Polybrene试剂 在Polybrene试剂存在的条件下向细胞中转导pLenti6.3/V5-GW/EmGFP。
EmGFP表达时间过短以致难以观察 如需获得最佳的EmGFP表达水平,请在转导4天后进行观察。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
低转导效率:
  • 转导过程中未应用Polybrene试剂
  • 使用了非分裂型的细胞
 
  • 在Polybrene试剂存在的条件下向细胞中转导pLenti6.3/V5-GW/EmGFP。
  • 以更高的MOI值向您的细胞中转导pLenti6.3/V5-GW/EmGFP。
MOI值过低 以更高的MOI值向您的细胞中转导pLenti6.3/V5-GW/EmGFP。
转导操作后过早收获细胞 至少在转导后48-72小时后再收获细胞——以让转导细胞中EmGFP表达和富集。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
启动子被沉默 pLenti6.3/V5-GW/EmGFP可能整合到某一染色体区域,进而造成CMV启动子(控制着EmGFP)的沉默。筛选多个耐受抗生素的细胞克隆,并挑选其中表达水平最高的一个。
在荧光显微镜下使用了错误的滤镜组来观察细胞培养物,或流式细胞仪上的检测参数错误 请确保在倒置荧光显微镜上使用FITC或Omega XF100滤镜组(参见 手册第7页)或在您的流式细胞仪上准确应用FITC检测参数。

这可能是由于在筛选过程中应用了过量的杀稻瘟素所致。通过开展杀伤曲线分析来确定您所用细胞系的抗生素敏感性。使用能够有效杀灭未转导细胞系的最低抗生素浓度。

使用HiPerform™ FastTiter™慢病毒载体转导细胞细胞所获得的EmGFP信号水平,未针对荧光显微镜的视觉评估应用进行专门优化。因此在使用这些载体时,我们推荐用户仅通过流式细胞术来检测转导细胞中的EmGFP荧光。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
Lenti3.3/TR载体整合到基因组的失活区 筛选其他的Geneticin抗性克隆。选择一株表现出Tet抑制子最高表达水平的细胞克隆,来作为Lenti6.3/TO/V5-DEST载体的宿主。
将Lenti3.3/TR转进CMV启动子下调的哺乳动物细胞系中 换用另一种哺乳动物细胞系来进行转导实验。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
加入四环素后过早收获和分析细胞
  • 加入四环素后将细胞培养更长时间,再分析重组蛋白的表达情况。请勿在加入四环素24小时之内收获细胞。
  • 在Geneticin筛选条件下种植细胞,通过杀灭未转导细胞来提升蛋白表达效果。
Lenti6.3/TO/V5-DEST慢病毒母液未经滴度测定 使用 手册第21页的步骤测定慢病毒母液。
Lenti6.3/TO/V5-DEST慢病毒母液未经正确保存
  • 分装母液并将其保存于–80°C条件下。
  • 请勿将病毒母液冻融超过3次。
  • 如果储存时间超过6个月,请在使用前重新测定病毒滴度。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
请勿将Lenti6.3/TO/V5-DEST慢病毒载体转导进四环素抑制子表达的细胞系中
  • 首先建立一株ViraPower™ T-REx™细胞系,之后将其作为Lenti6.3/TO/V5-DEST的宿主。
  • 执行共转导步骤(参见 手册第27-30页)。请确保在Lenti3.3/TR慢病毒转导哺乳动物细胞至少24小时后,再进行Lenti6.3/TO/V5-DEST慢病毒的转导操作。
忘记加入四环素 为了在Lenti6.3/TO/V5-DEST转导后成功诱导目的基因的表达,用户需加入终浓度为1 g/mL的四环素成份。等待至少24小时之后,再检测重组蛋白的表达情况。

这可能是由Lenti6.3/TO/V5-DEST载体转导进不表达Tet抑制子的细胞所致。首先建立一株ViraPowerTM T-RExTM细胞系,之后将其作为Lenti6.3/TO/V5-DEST的宿主。您可能需要确认在细胞生长培养基中未使用含较高四环素水平的FBS。

这里列举了一些可能的原因与解决方案:

原因 解决方案
相对表达载体而言,Lenti3.3/TR病毒载体转导的MOI值过低 向哺乳动物细胞转导Lenti3.3/TR病毒载体需使用比表达载体(一般MOI=1-5)更高的MOI值(如MOI=10)。
转导Lenti3.3/TR病毒载体之后和转导Lenti6.3/TO/V5-DEST病毒载体之前,未等待足够长的时间 向哺乳动物中转导Lenti3.3/TR载体,等待24小时之后再转导Lenti6.3/TO/V5-DEST载体。

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