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报告基因载体

除了进行了关键突变以增加Clontech荧光蛋白亮度之外,我们还进行了遗传增强元件改造,以提升荧光量子产率。平行对比结果显示Vivid Colors™荧光蛋白表达载体的荧光强度至少与对应的Clontech BD Living Colors™荧光蛋白表达载体相当(或更好)。 

EmGFP是EGFP的下一代变体,在哺乳动物体内表达效果更优。EmGFP和EGFP均可通过相同的滤光片组(FITC)和参数设定来实现可视化操作。在使用了推荐的滤光片组和参数设定的条件下,Cycle 3 GFP与EGFP或EmGFP一样明亮。不过,当使用FITC滤光片组及相关设定时,Cycle 3 GFP不如EmGFP或EGFP明亮。

EGFP的激发/发射最大波长:488 nm/507–509 nm
EmGFP的激发/发射最大波长:487 nm/509 nm
Cycle 3 GFP的激发/发射最大波长:395 nm (第一)和478 nm(第二)/507 nm 

是的,我们所提供的所有荧光蛋白(EmGFP,YFP,CFP,BFP和Cycle 3 GFP)均经过人源基因密码子优化以适合哺乳动物表达系统。 

我们所提供荧光蛋白的激发/发射最大波长如下所述:
EmGFP:激发:487 nm;发射:509 nm
YFP:激发:514 nm;发射:527 nm
BFP:激发:308-383 nm;发射:440-447 nm;
CFP:激发:452 nm;发射:505 nm
Cycle 3 GFP:第一激发波长:395 nm;第二激发波长:478 nm;发射:507 nm

EmGFP,YFP,CFP和BFP均可通过标准的FITC滤光片组和参数设定来进行检测。不过,如需获得荧光信号的最佳检测结果,我们推荐用户针对每一种荧光蛋白的激发与发射波长范围来优化滤光片组。推荐的滤光片组如下所述:

EmGFP:Omega滤光片组XF100

YFP:Omega滤光片组XF1042
Chroma滤光片组41028

CFP:Omega滤光片组XF114
Chroma滤光片组31044

BFP:Omega滤光片组XF10
Chroma滤光片组31021

如需索取滤光片组的相关信息,请直接联系Omega Optical公司(www.omegafilters.com)或Chroma 技术公司(www.chroma.com)。 

Cycle 3 GFP的荧光可通过适用于野生型GFP的滤光片组来完成检测(因为它们具有相同的荧光光谱)。在内部实验中,我们一般使用Omega Optical公司所提供的XF76滤光片组。Cycle 3 GFP的激发光谱为395 nm,发射光谱为507 nm。您也可对发射光谱进行观察,并记录200-800 nm处的发射情况。

Cycle 3 GFP的荧光可通过具有适当滤光片和截止波长的任意种类的荧光分析仪器进行定量。在内部实验中,我们一般使用Hitachi F-2000荧光分光光度计。我们应用此仪器的常规方案如下:
使用PBS稀释样本(也可使用Tris缓冲液或水)。裂解液的用量需要基于GFP的浓度来进行调整。这一用量一般是根据经验来确定的。第一个需要考虑的是样本浓度应处于荧光分析仪器的线性区间。我们在一个比色皿(已添加1ml PBS)中应使用5-50 µL的样本量。如需对这些读值进行分析比较,则最好能够将裂解液的用量按照转染效率和总蛋白浓度进行归一化运算,以帮助获得最为稳定的结果。

我们推荐在进行β-半乳糖苷酶染色前观察GFP荧光。这是因为β-半乳糖苷酶染色过程会产生非常高的自发荧光,从而干扰GFP荧光的检测。 

我们提供pJTI™ R4 Exp CMV EmGFP pA载体(货号A14146),你们可使用这一产品来监控您的转染和表达情况。

是的,我们提供pBlue-TOPO®和pGlow-TOPO®载体,目的基因的DNA序列能够轻松插入到β-半乳糖苷酶或Cycle 3 GFP基因上游。

pBlue-TOPO®是进行低转录活性启动子功能分析的理想载体,,因为β-半乳糖苷酶检测实验易于操作,且可以在非常低的表达水平下进行定量。pGlow-TOPO®是在天然活体细胞中针对启动子元件开展非侵入性分析的理想之选。在使用带有野生型GFP滤光片组的显微镜,或荧光激活的细胞分选法的过程中,Cycle 3 GFP的荧光性质能够满足几乎任何细胞类型或物种的体内检测需求。

pBlue-TOPO®中的lacZ报告基因上游隐含了一个原核启动子,通过X-Gal平板进行筛选时,大肠杆菌的转化子会呈现浅蓝色。因此,我们不推荐用户使用pBlue-TOPO®来评估大肠杆菌中的启动子功能。不过,pGlow-TOPO®适用于此类研究。请注意pBlue-TOPO®载体中β-半乳糖苷酶的背景表达不会出现于哺乳动物细胞中。

Lumio™染色技术的优势在于可同时兼容体内和体外的蛋白标记操作。在体内标记实验中,向细胞中加入Lumio™试剂后即可在荧光显微镜下观察到细胞/蛋白。这一效果与GeneBLAzer®检测步骤相似,只是GeneBLAzer®是基于扩增报告基因信号的酶促反应。GFP的荧光信号只能在细胞(体内)中检测到,因为需要GFP蛋白的正确折叠。相比GeneBLAzer®检测法中的bla蛋白(264个氨基酸,29 kDa)和GFP蛋白(27 kDa)而言,Lumio™标签非常之小(6个氨基酸,585Da),因此在很大程度上不会对所融合蛋白的功能造成影响。GFP的劣势在于需要融合一个很大的标签蛋白,而且该检测法并非是基于酶法的报告系统。不同于GeneBLAzer®检测法和GFP标签,Lumio™-标签蛋白可在Lumio™试剂处理细胞裂解液或蛋白之后通过凝胶电泳变得可视化。与Lumio™和GFP相比,GeneBLAzer®检测法在活体细胞的应用中更为灵敏。GeneBLAzer®检测法也不同于Lumio™和GFP,这一方法能够实现比率化的读数,因此有助于减少样本间的差异。

我们尚未在细胞中发现用于蛋白检测浓度的Lumio™试剂具有任何不良效应。我们也未在使用Lumio™ Green之后发现细胞形态出现任何不良改变。加入Lumio™ Red后,我们确实发现细胞发生了某些微小的形态改变,不过这一变化在加入试剂24小时之后恢复。 

哺乳动物细胞培养基中的血清蛋白(如BSA,66KD)可能会与Lumio™试剂发生交叉反应,从而形成非特异性的条带。吸去细胞培养基并在收获细胞后使用PBS润洗哺乳动物细胞3-4遍,有助于减少BSA的非特异性结合。 

Lumio™试剂具有疏水性,因此很容易穿过细胞膜。无需通过透化处理来帮助该试剂进入细胞内部。 

特殊载体

您可设计一条双顺反子转录本实现这一操作 - 即在这一转录本中,两个基因之间通过一个内部核糖体进入位点(IRES)序列分隔开来,从而在同一个公用的上游启动子控制下,分别作为两个单独的转录读码框实现表达。另外,您也可以使用包含两个独立启动子的载体来起始两个不同基因的表达,从而更为有效地控制细胞中的基因拷贝数。我们提供pBud/CE4.1载体(货号 V53220),基于同一质粒来独立表达两个基因。该质粒同时包含CMV和EF1α启动子,为两个基因提供近乎均等的表达水平。这一载体同时携带了Zeocin™抗生素抗性基因,来辅助用户开展稳转筛选。

我们为您提供pVAX1载体,货号 V26020,本品是按照FDA指南设计,满足此类需求的载体。。此载体中的真核DNA序列被缩减至表达所需的最少序列,这样就能将染色体整合的可能性降至最低。该载体将用于原核筛选的氨苄青霉素,用卡那霉素进行了代替,据报导氨苄青霉素会在某些个体中造成过敏反应。

我们提供pDisplay™载体(货号 V66020),本品用于将重组蛋白靶向定位至哺乳动物细胞膜表面。本载体包含了N端的小鼠Ig kappa-链分泌信号和C端源自血小板来源生长因子受体(PDGFR)的跨膜锚定域,能够帮助目的基因靶向定位并锚定于细胞膜表面。

向哺乳动物细胞中转染pDisplay™空载不会向细胞膜呈递多肽,因为Ig kappa信号肽和PDGFR跨膜域并不处于同一读码框中,包含kappa信号肽的ORF在PDGFR跨膜域起始位点前的5bp处。 

胰酶会消化任何蛋白中的精氨酸和赖氨酸残基,这是业界存在的广泛共识:胰酶处理细胞时膜蛋白的胞外域会被消化。不过在常规情况下,一旦胰酶被移除,这些蛋白便会迅速被重新置换。作为胰酶的替代品,您可使用Versene(货号 15040066)来解离绝大多数的贴壁细胞,这是一种含0.5 mM EDTA的PBS溶液,也/或可刮取细胞。EDTA能够螯合任何游离的Mg2+或Ca2+离子,而这些离子对于许多贴壁细胞维持粘附状态都是必需的。基于Hank's溶液的(货号 13150016)或基于PBS溶液的(货号 13151014)无酶细胞解离缓冲液均为螯合剂混合物,也能够胜任这类应用,可能比单用EDTA更为有效,而且不会对受体蛋白造成不良影响。

当我们尝试使用FACS技术和anti-myc抗体来分选pDisplay™转染的细胞时,分选效果并不是非常好。不过,pDisplay™转染的细胞可通过磁珠来进行分离:首先将细胞与anti-myc抗体进行孵育,之后再将细胞-抗体复合物与抗小鼠IgG1偶联的磁珠进行孵育。最后就可通过磁力架将细胞分离出来了。

您可向目的基因的上游插入一个N端分泌信号或引导肽(同一读码框中),来促进蛋白的分泌表达。我们提供pSecTag2(货号V90020)和pSecTag2/Hygro(货号V91020)两款产品,来满足此种需求。这些载体的N端均包含了小鼠Ig kappa链分泌信号,用于帮助实现目的蛋白的分泌型表达。

这些载体之间的差别仅在于pSecTag2载体包含了用于进行稳转筛选的Zeocin™抗生素抗性基因,而pSecTag2/Hygro载体则包含了用于进行稳转筛选的潮霉素B抗性基因。

可以,您可在大肠杆菌中通过Zeocin™抗性来进行筛选。不过,请切记如需激活Zeocin™抗性,培养基中的盐浓度必须维持在较低水平(<90 mM),pH值须为7.5。请使用低盐(5 g NaCl/L)LB来制备LB培养基和LB琼脂平板。 

pSectag2载体含有用于大肠杆菌筛选的Zeocin™抗生素抗性基因,任意一种包含完整Tn5转座子元件的大肠杆菌菌株(即DH5αF’IQ,SURE,SURE2)都会编码ble(博来霉素)抗性基因,从而能够耐受Zeocin™抗生素。因此,如需实现最高效的筛选操作,我们强烈推荐使用不含Tn5基因的大肠杆菌菌株。

(+)和(-)指示符意味着这些载体中多克隆位点的方向。提供两种方向的载体能够方便用户开展克隆操作。

pShooter™载体经设计适用于将重组蛋白靶向定位于胞内细胞器,如细胞核(pEF/myc/nuc和pCMV/myc/nuc),线粒体(pCMV/myc/mito),内质网(pCMV/myc/ER),或胞浆(pCMV/myc/cyto)。 

pCMV/myc/ER载体中的ER定位信号是由帮助蛋白进入分泌腔的N端信号肽,和将蛋白滞留于ER的C端肽段(SEKDEL)所组成的。这样就能通过受体结合作用来把蛋白滞留于ER中。有关这一载体的原始文献为:Munro S and Pelham HRB (1987) A C-Terminal Signal Prevents Secretion of Luminal ER Proteins.Cell 48:899–907. 

在pCMV/myc/mito载体中,线粒体定位信号为N端的信号肽(人类细胞色素C氧化酶第VIII亚基的前导序列),这一信号能够帮助融合蛋白穿过线粒体膜。信号肽随之被切除,融合蛋白就进入线粒体中(也可能与线粒体内膜相结合)。

我们的附加型哺乳动物表达载体(pCEP4,pREP4和pEBNA-DEST)包含了非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)来源的复制起点(oriP)和非洲淋巴瘤核抗原(EBNA-1),适用于在人、灵长类、犬和猪细胞系中进行瞬时或稳定的高拷贝附加型复制。它们在小鼠或大鼠下细胞系中不会发生附加型复制。pEBNA-DEST也适用于干细胞。

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