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概述

使用Neon®设备所获得转染效率较低的可能原因包括:

  1. 电学参数未优化彻底
  2. 所制备质粒中盐份较高
  3. 质粒大于10 kb
  4. 质粒浓度过低
  5. 细胞应激,受损,或被支原体污染
  6. 细胞密度过低或过高
  7. 细胞传代次数过多

使用Neon®设备后细胞存活率较低的可能原因包括:

  1. 电学参数未优化彻底
  2. 质粒品质不佳,如存在内毒素污染
  3. 所制备质粒中盐份较高
  4. 质粒用量过多
  5. 细胞应激或受损
  6. 多次使用同一Neon®枪头
  7. 枪头中存在微小气泡,从而导致电弧作用

是的。我们推荐您以琼脂糖凝胶来检验DNA的完整性,观察其是否发生降解。超螺旋的质粒会比线性质粒泳动得更快。带切口的质粒将比线性质粒泳动得更慢。您所制备DNA产物中的“带切口”DNA成份应低于20%。更高比例的带切口DNA会导致转染效率的显著下降。

是的。为了检查DNA的质量,我们强烈建议您检测A260:A280的比值。对于品质良好的DNA制备物,该比值至少应达到1.6以上。

不会,这些沉淀是不可逆的。如果该Neon®试剂盒仍在1年有效期内,请联系技术支持部门进行更换。 

对于大质粒而言,制备高度浓缩的质粒十分重要。就对照质粒而言,10 mL电转需使用0.5 mg的数量,对照质粒的大小为5.5 kb左右。让我们假设所使用的大质粒为50 kb。它差不多有对照质粒的50倍大小,这样您就需要使用10倍质量的质粒来满足摩尔数。这样您就需要在10 mL电转体系中使用5 mg质粒。为了覆盖这一巨大的质粒量,质粒浓度就需要超过 5mg/mL。需要牢记的是当您加入大量质粒时,质粒样本本身即可造成毒性,从而损伤细胞。因此,我们推荐优化和减少质粒的起始用量,经检测细胞活力和转染效率再提高质粒用量。 

这一现象有几种可能的原因:单核细胞与巨噬细胞会响应极低水平的内毒素(LPS),而后者可能由您的质粒DNA引入的。请确保您使用的质粒DNA经过例如PureLink® HiPure质粒纯化试剂盒一类的阴离子交换层析法的纯化。如果您仍然观察到激活现象,您可能需要对质粒进行第二轮的阴离子交换层析纯化。如果您仍无法避免细胞激活的现象,则质粒中可能包含了刺激gamma干扰素合成的序列。也可能您的培养基(包括本批FBS)中存在某些成份导致了激活效应。请确保没有这些成份激活细胞。分离单核细胞的步骤也同样很重要。我们推荐阴性筛选而非阳性筛选,因为这样的筛选过程能够让单核细胞不“碰触”抗体。我们的电转缓冲液能够确保不含内毒素成份,因此不会导致单核细胞/巨噬细胞的激活。

如需测定siRNA的Neon®转染效率,我们推荐使用荧光标记的阴性对照siRNA来转染细胞(BLOCK-iTTM荧光寡聚物,目录编号13750062),并通过检测活细胞中荧光染色细胞的百分比来确定转染效率。不过,在使用此方法时请切记:通过荧光标记的阴性对照siRNA所确定的转染效率有高估转染效率的可能,这是因为通过显微镜进行的荧光检测无法区分进入胞内的siRNA和粘附在胞膜上的siRNA。如需更为准确地测定转染效率,需要使用阳性对照siRNA(如靶向看家基因的siRNA)转染细胞,再检测靶标RNA或蛋白的敲低效果即可。

电弧作用可由DNA制备物中较高的盐份,高细胞密度和枪头活塞末端形成气泡等原因导致。请观察活塞底部是否出现微型气泡,这些气泡可能由急速的加样操作所致,或由过于剧烈混匀的样本产生。你应以平缓连续的动作来进行加样,以避免吸入空气。

如果您检查了所有上述原因后仍遇到严重的电弧问题,那么可能是您使用了一批旧枪头,这些枪头活塞的阻抗可能已经较低,从而导致气泡形成和电弧。如果确是这一原因所致,我们则建议您换用一批新枪头。

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