实验时遇到问题?

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概述

冷冻可能会改变脂质体的完整性与组成。试剂的性能可能会受到影响,在一周左右的时间内使用可能还可以。购买一管新试剂是更保险的保障产品性能的做法。

可以,我们所有的脂质体转染试剂均能够在室温下稳定保存数月。

此处收录了一些转染效率低的可能原因及其相应的解决建议。

此处是一些转染后细胞活性降低的可能原因及其相应的解决方案。请注意,最近的研究结果显示,转染过程中可在培养基中使用抗生素。我们对多个细胞系在含与不含抗生素的培养基中的转染效果进行了比较,同时评估其转染效率和细胞毒性,结果显示并无差别。对稳定转染而言,转染操作后至少等待72小时以上,再加入选择性抗生素。

请查看这份转染重复性不佳的可能原因与解决建议。同时,我们也推荐为多次转染操作配制一份总的DNA/脂质体复合体预混液,以减少由多次取样所导致的误差。当您加入复合物时,我们推荐在不同孔之间更换枪头,因为重复使用同一枪头会带入残留,特别是对于96孔或384孔板小体积形式而言影响可能更大。

脂质体转染后在细胞上观察到沉淀的通常原因是体系中现存EDTA或阳离子脂质体过量。我们推荐用水稀释DNA,如果希望使用TE溶液,则EDTA的浓度应低于0.3 mM。同时请确保在复合物配制过程中,阳离子脂质体试剂的浓度不要超过推荐用量。这一沉淀物的存在与否与转染性能之间并无相关性。

使用阳离子脂质体转染可能会产生明亮的颗粒状橙色背景荧光。橙色荧光与脂质体/DNA复合物有关而与GFP无关。这一背景荧光随着所用阳离子脂质体试剂的不同而变化,但不会对转染结果造成干扰。

Lipofectamine 3000转染试剂

冷冻可能会改变脂质体的完整性与组成。试剂的性能可能会受到影响, 在一周左右的时间内使用可能还可以。使用一管新试剂比较有保障。

可以,我们所有的脂质体转染试剂均能够在室温下稳定保存数月。

Lipofectamine MessengerMAXTM转染试剂

我们也在mRNA的早期 转染实验中观察到一些毒性。不过,向体外转录模板中整合入适当的5'UTR和3'UTR序列迅速解决了这一问题。另一个关键因素是mRNA的纯度。请确保其OD 260/280的比率介于1.8和2.1。mRNA的品质可通过少量凝胶电泳——检查准确大小的片段来确定。在某些情况下,在转录反应中使用经化学修饰的核苷酸也可能是最佳选择。另一个造成细胞毒性的可能原因是细胞自身;如果细胞密度过低,则有可能引起明显的毒性(转染当天理想的细胞密度介于70-90%汇合度之间)。

我们自身所有的实验室也都观察到此种现象。确定此问题之后,我们制定了一套最佳的实用标准 - 即只使用5-20代的细胞进行转染实验,因为传代次数少的细胞转染率非常低,而对传代次数较多的细胞而言,其转染最佳剂量会不同。我们也实施了一套阳性对照的标准用法,这样每次转染实验都可定量地检测转染效率,并进行周与周之间的效率跟踪。

转染后有一些因素会影响表达,但在逐一排除这些可能性之前,应使用阳性对照报告基因和Lipofectamine MessengerMAXTM mRNA转染试剂来尝试转染实验。 如果这一操作仍未获得良好的转染结果,最好尝试使用一种替代的导入方法或换用另一种细胞。不过,如果这一实验获得了可接受的结果,下一步则可尝试使用mRNA和MessengerMAXTM试剂。如果此时仍未获得理想的表达水平,则可能是所使用mRNA的问题,故障排除可能需要从此方面出发来考虑。举例来说,一些可能涉及的问题包括:有5’帽吗?有多聚A尾吗?mRNA纯度如何?是否在凝胶电泳中获得了单一条带?DNA模板是否纯净?

Lipofectamine RNAiMAX转染试剂

冷冻可能会改变脂质体的完整性与组成。试剂的性能可能会受到影响,在一周左右的时间内使用可能还可以。使用一管新试剂比较有保障。

可以,我们所有的脂质体转染试剂均能够在室温下稳定保存数月。

检查转染过程中培养基中是否加入了抗生素,那可能是导致细胞死亡的原因。测试无血清培养基是否兼容Lipofectamine RNAiMAX试剂。

Invivofectamine 2.0转染试剂

这很正常。只需通过轻柔震荡来重悬沉淀,即可按照推荐用法继续使用。

检查柱体是否过载。我们建议每个柱体的载入量不要超过15至30 mL。我们推荐将样本分入两个柱体进行离心处理。

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