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Präsentationen

Beschreibung


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PRRS-Virusüberwachung: Bedeutung der Sequenzierung und des Nachweises von Viren mittels PCR

PRRSV mutiert häufig, weshalb wir ständig die PRRSV-Stämme überwachen. Dadurch stellen wir sicher, dass wir die aktuellste PCR-Lösung bieten, damit unsere Kunden mit Sicherheit arbeiten und alle betreffenden Stämme nachweisen können. Durch die Überwachung der zirkulierenden europäischen PRRSV-Stämme mit Sequenzierungstechnologien wird die Sequenzierung von direkt von den Feldproben isolierter RNA ermöglicht. Sequenzierungsansätze bieten die Möglichkeit, neue PRRSV-Stämme zu identifizieren, was die Leistung eines Diagnosetools für den PRRSV-Nachweis erhöht. Der in der Entwicklung befindliche Applied Biosystems VetMAX PRRSV EU & NA Assay ist darauf ausgelegt, die Wirksamkeit von PRRSV-Überwachungsprogrammen im Feld mit dem Nachweis der vier Subtypen des europäischen PRRSV-Genotyps und einer diagnostische Sensitivität von 99 % zu verstärken. Thermo Fisher Scientific bietet eine Reihe von angepassten Arbeitsabläufen von Probenahme- und Extraktionsmethoden bis hin zu Sequenzierungslösungen.

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Bewertung des VetMAX PEDV/TGEV/SDCoV-Kits, einer Multiplex Real-Time-RT-PCR-Methode für den Nachweis des Coronavirus der Schweine

Das Applied Biosystems VetMAX PEDV/TGEV/SDCoV-Kit wurde mit verschiedenen Arten von Umgebungs- und verwandten Proben entwickelt, die aus dem Feld stammen, und es weist eine hohe Spezifität und Sensitivität auf. Um seine Leistungsfähigkeit im Vergleich mit der von Lösungen anderer Hersteller zu untersuchen, haben wir es mit zwei vergleichbaren Kits verglichen, die häufig in diesem Bereich verwendet werden. Aus dem Feld stammende und mit PEDV (N=15), TGEV (N=10) und SDCoV(N=14) infizierte Umwelt-, Speichel- und Fäkalproben wurden unter Verwendung von negativen, positiven und Nicht-Template-Kontrollen untersucht. Die RT-qPCR wurde für die Kits aller drei Hersteller auf dem Applied Biosystems Fast Real-Time PCR System gemäß den Empfehlungen des Herstellers ausgeführt. Das VetMAX PEDV/TGEV/SDCoV-Kit wies gleichwertige oder bessere Ergebnisse als die anderen getesteten Kits mit konsistent niedrigeren CTs im Vergleich zu einem der anderen Kits sowie einem höheren Signal gegenüber dem Basislinienrauschen im Vergleich zum anderen auf.

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Entwicklung und Validierung eines neuen Tuberkulose-Real-Time-PCR-Kits

Die Rindertuberkulose (TB) ist eine chronisch verlaufende Erkrankung, die Rinder und Wildtiere befällt und primär durch Mycobacterium bovis verursacht wird. Das Applied Biosystems™ VetMAX™ M. tuberculosis Complex Kit (MTBC), ein neues molekulares Werkzeug, ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Mykobakterien, die zum Mycobacterium-tuberculosis-Komplex (MTBC) gehören, und einer internen Kontrolle. Um die Leistungseigenschaften des Kits nachzuweisen, wurden Verifizierungsstudien an Rindern und unterschiedlichen Wildtieren durchgeführt.

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Entwicklung und Validierung des VetMAX™-Gold MAP Nachweiskits

Das vom Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten (USDA) lizenzierte VetMAX™-Gold MAP Nachweiskit ist ein Real-Time-PCR-Assay für den schnellen In-vitro-Nachweis von aus Rinderfäkalien aufbereiteter MAP-DNA. Der Assay zielt auf ein eindeutiges Sequenzelement im MAP-Genom ab, um hoch empfindliche und spezifische Ergebnisse zu liefern. Zweck dieser Studie ist die Bestimmung der Leistungsmerkmale des VetMAX™-Gold MAP Nachweiskits beim Nachweis von MAP-DNA aus Nukleinsäure, die aus einzelnen und gepoolten Rinderfäkalienproben extrahiert wurde.

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Auf Anhieb das richtige Ergebnis mit Xeno Internal Positive Control

Tierische Probenmatrices, die für diagnostische qPCR-Tests verwendet werden, können eine Reihe von PCR-Inhibitoren enthalten, die potenziell zu falsch negativen Ergebnissen führen können. In dem Bemühen, präzisere Diagnosen bei Krankheiten von landwirtschaftlichen Nutztieren zu ermöglichen, haben wir eine interne Positivkontrolle entwickelt, die sich einfach in bestehende TaqMan™-basierte Arbeitsabläufe für Tests auf das Vorhandensein von PCR-Inhibitoren integrieren lässt und somit das Risiko von falsch negativen Ergebnissen senkt.

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Überwachung von europäischen PRRSV-Stämmen mithilfe von Sequenzierungstechniken

PRRS wird durch ein einsträngiges RNA-Hüllvirus positiver Polarität mit einer hohen Mutationsrate hervorgerufen, die zu einer größeren Heterogenität der Nukleotidsequenz zwischen den einzelnen Stämmen führt. Die hohe genetische Diversität des Virus erhöht das Risiko einer reduzierten Empfindlichkeit für das Echtzeit-RT-PCR-Diagnosewerkzeug. Das Ziel der vorliegenden Studie war die europaweite Überwachung des zirkulierenden PRRSV-Stammes mithilfe der ORF7-Kapillarsequenzierung und NGS-Technologie.

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Prävalenz von Tritrichomonas foetus bei Rinderbullen im Bundesstaat Chihuahua, getestet mit dem MagMAX™ Probenvorbereitungssystem und VetMAX™-Gold Trich Nachweiskit

Die Prävalenz der Trichomonadenseuche in Mexiko und insbesondere im Bundesstaat Chihuahua ist unbekannt, da keine weit reichenden Diagnosetests implementiert wurden. Das Ziel dieser Studie bestand daher darin, die Prävalenz der Trichomonadenseuche bei Rinderbullen im Bundesstaat Chihuahua mit einem Molekulardiagnostiktest auf Basis der Real-Time PCR zu bestimmen: dem vom Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten (USDA) lizenzierten VetMAX™-Gold Trich Detection Kit.

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Entwicklung und Validierung eines kompletten Arbeitsablaufs für SIV-Tests

Wir haben einen Arbeitsablauf für SIV-Tests validiert, der aus der Hochdurchsatzreinigung der Nukleinsäure, dem SIV-Nachweis und der SIV-Subtypisierung mittels Nasenabstrichen von Schweinen besteht. SIV kann mithilfe des von der USDA-lizenzierten VetMAX™-Gold SIV Nachweiskits nachgewiesen werden, einem Ein-Schritt-Echtzeit-RT-PCR-Kit mit einzelnem Röhrchen für präzises Screening auf Influenza A. Der Assay zielt auf drei unabhängige Regionen des SIV-Genoms ab, um die Anzahl von falsch negativen Ergebnissen aufgrund von Mutationen des viralen Genoms deutlich zu reduzieren.

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Werkzeuge für die frühzeitige und einfache Diagnostik für das Bestandsmanagement von PRRSV: Ein Vergleich der Probenahme und Prävalenz unter Feldbedingungen

Die Hauptziele von mehreren Studien bestanden in der Validierung der Speichelprobenahme im Vergleich zu Methoden auf Grundlage einer Blut/Serum- und Gewebeprobenahme, sowie in der Abgabe einer Empfehlung für die Speichelprobenahme unter Feldbedingungen zur schnelleren Diagnose von PRRSV mit einer einfacheren Probenahmemethode. Thermo Fisher Scientific bat mehrere Labore und Forschungsinstitute rund um die Welt, die Real-Time-PCR-Werkzeuge anhand von über 800 Feldproben verschiedener Genotypen zu evaluieren. Feldstudien in Europa und Nordamerika ermöglichten die Bewertung der Leistung des Kits für Speichelproben.

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Neue Einblicke in Speichelproben als Diagnoseverfahren für den Nachweis und die Bestimmung von PRRSV unter Feldbedingungen

Basierend auf Versuchen mit europäischen und nordamerikanischen Stämmen des Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-Virus (PRRSV) ist die Wahrscheinlichkeit des Nachweises von PRRSV in Speichel signifikant an die PRRSV-Prävalenz in Serum (p<0,0001) gekoppelt. Wenn die Serumprävalenz höher als 50 % beträgt, liegt die Wahrscheinlichkeit des Nachweises dieses Virus in Speichelproben nahe bei 1. Die Speichelprobenahme ist daher ein geeignetes Werkzeug für den Nachweis des PRRSV auf der Bestandsebene, eignet sich jedoch nicht für die Bestimmung der Prävalenz dieser Erkrankung.

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Entwicklung und Validierung eines neuen ASFV-Real-Time-PCR-Kits

Das African Swine Fever-Virus (ASFV) ist eine meldepflichtige, hoch ansteckende Krankheit, die erhebliche wirtschaftliche Verluste verursachen kann. Da weiterhin keine Impfung oder Therapie zur Verfügung steht, ist die Überwachung des ASFV mittels Diagnostik das einzige Verfahren zu dessen Kontrolle und somit von größter Bedeutung. Es wurden ein neues Duplex-Real-Time-PCR-Kit, das auf das Gen p72 abzielt, sowie eine interne Kontrolle entwickelt und deren Leistung für die Diagnose des ASFV beurteilt.

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Warum die Standardisierung von Vorschriften und Labortestverfahren für Trichinenuntersuchungen über bundesstaatliche Grenzen hinweg für Rindfleischproduzenten wichtig ist

Dr. Kathy Simmons, leitende Tierärztin der National Cattlemen's Beef Association, Washington DC. Harmonisierte bundesstaatliche Vorschriften für Trichinenuntersuchungen bei der Verbringung von Rindern über die Grenzen von Bundesstaaten hinweg würden diese mit der vom Handel geforderten Geschwindigkeit ermöglichen. Gut definierte, durchdachte und gegenseitig anerkannte Testverfahren für Trichomonadenseuche zwischen benachbarten Bundesstaaten können redundante Testverfahren eliminieren und die Gefahr für Tiere und Untersuchende durch wiederholte oder unnötige Tests reduzieren.*

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Wie der Bundesstaat Kansas die aktuellen Vorschriften für Trichinenuntersuchungen und anerkannte Diagnosetestverfahren einführte

Dr. Bill Brown, Animal Health Commissioner, Kansas Department of Agriculture, Topeka Kansas. Ein Überblick über die Einführung von neuen, umfassenderen Vorschriften für Trichinenuntersuchungen bei Eigentümerwechseln innerhalb des Bundesstaates und die Verbringung sowie Diagnosetests über Bundesstaaten hinweg in Kansas. Dr. Brown beauftragte eine Trichinen-Arbeitsgruppe, die aus vier Tierärzten und vier Rindfleischproduzenten bestand, mit der Evaluierung der Verbesserung des Trichinen-Managements im Bundesstaat Kansas.*

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Warum die Standardisierung von bundesstaatlichen Vorschriften für Trichinenuntersuchungen sowohl für Tierärzte als auch für Rindfleischproduzenten von Vorteil ist

Dr. Jeremy VanBoening – Republican Valley Medical Center, Alma / Holbrook / Franklin Nebraska. Dr. VanBoening stellte unter staatlichen Diagnoselabors erhebliche Unterschiede bei den empfohlenen Verfahren für die Probenahme fest. Unter anderem wird in den Labors uneinheitlich gehandhabt, ob Proben bebrütet oder auf Eis gelegt werden, wie die Proben versendet werden und welche Medien für die Probenahme verwendet werden. Standardisierte Laborempfehlungen für die Entnahme und Handhabung würde die Qualität der zur Untersuchung übermittelten Proben verbessern.*

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Entwicklung eines Arbeitsablaufs für die Influenza-A-Sequenzierung am Ion PGM™ Sequenziergerät zur Verbesserung der Überwachung

Die Sequenzierung des vollständigen Genoms ist für die fortlaufende Identifizierung, Überwachung und Charakterisierung des Influenza-A-Erregers von grundlegender Bedeutung. Bei der Sequenzierung von viralen Genomen können Hintergrund-Wirtsnukleinsäuren während der Library-Vorbereitung mitverarbeitet werden, was zu einer Sequenzierungsreaktion führt, in der die Mehrzahl von Ablesungen durch das Wirtsgenom aufgenommen werden. Eine Lösung für dieses Problem ist die Durchführung einer Präamplifizierung

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Nachweis des Influenza-A-Virus anhand von Speichel und Nasenabstrichen bei IAV-beimpften
Schweinen

Der IAV-Nachweis in Schweinepopulationen mithilfe von Nasenabstrichproben ist arbeitsintensiv und relativ unempfindlich bei fieberfreien Schweinen (1). Alternativ haben sich Speichelproben als ausgezeichnete Überwachungsproben für verschiedene Atemwegsviren beim Schwein erwiesen (2, 3, 4). Das Ziel dieser Studie war der Vergleich der IAV-Nachweisrate per RT-PCR, Virenisolation (VI) und mit dem VetScan® Test (Abaxis Inc.).

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Korrelation zwischen einem handelsüblichen PCR-Assay und der HEYM-Kultur für MAP in Rinderfäkalienproben

Krankheitskontrollprogramme für Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) erfordern präzise und empfindliche Werkzeuge für die Erkennung von infizierten Tieren. Der kulturbasierte Nachweis von MAP dauert mehrere Wochen, während das PCR-Verfahren einen schnellen Nachweis ermöglicht. Für den Nachweis von MAP in Rinderfäkalienproben gibt es mehrere kommerzielle und von Anwendern entwickelte PCR-Assays.

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Festlegung eines angenommenen diagnostischen Schwellenwerts für persistent infizierte Rinder

Das Bovine Virusdiarrhö-Virus verursacht bei Rindern Infektionen, die zu bedeutenden wirtschaftlichen Verlusten in der Rindfleisch- und Molkereiindustrie geführt haben. In-utero-BVDV-Infektionen können zur Immuntoleranz führen, sodass Tiere lebenslang dauerhaft infiziert (PI, persistently infected) bleiben. Dauerhaft infizierte Tiere streuen das Virus kontinuierlich und sind die Hauptquelle für BVDV-Infektionen in Beständen. Tiere, die akut oder transient infiziert sind, durchlaufen die Krankheit und zeigen

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Poolen von gezüchteten Tritrichomonas-Feotus-Proben, gefolgt von einer Aufbereitung mit dem MagMAX™ Probenvorbereitungssystem und einer Amplifizierung mit Applied Biosystems qPCR-Reagenzien

Die Ziele dieser Studie waren: 1) der Vergleich mehrerer Arbeitsabläufe für die Probenvorbereitung (Sieden, QIAGEN, MagMAX™) und zurzeit von Diagnosetestlabors verwendeten PCR-Assays mit MagMAX™ und Applied Biosystems VetMAX™ Reagenzien für individuelle Tests auf T. foetus und (2) die Bewertung der Durchführbarkeit.

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Standardisierte Probenvorbereitung für verschiedene Probenmatrices

Es gibt zahlreiche verschiedene Methoden, um unterschiedliche Probenmatrices zu vergleichen. Dies kann bei Forschern, die mit mehreren Probentypen arbeiten, zu Verwechslungen und Frustrationen führen. Diese Zusammenfassung beschreibt das MagMAX™ Pathogen RNA/DNA Kit. Dieses Kit wurde zur Schaffung einer standardisierten Lösung entwickelt, mit der Labore nur ein Kit für vielfältige Probenmatrices sowie unterschiedliche Eingangsvolumen für jede Probe zu bestellen brauchen. Erfolgreiche Arbeit im Labor ist die Folge.

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