Wir haben chemische Verfahren für den Nachweis von PCR-Produkten mit Geräten für die Real-Time PCR entwickelt:

Welches Nachweisverfahren ist für Sie das richtige?

  Nachweis mittels SYBR Green   Nachweis mittels TaqMan
 
 
Verwendet Applied Biosystems™ SYBR™ Green Farbstoff (ein dsDNA-bindender Farbstoff) zur Erkennung des PCR-Produkts, während es sich bei der PCR anreichert.
 
 
Verwendet eine fluorogene Sonde, die für das Zielgen spezifisch ist, zur Erkennung des Ziels, während es sich bei der PCR anreichert.
Spezifität Mittel*   Hoch
Empfindlichkeit für niedrige Kopienzahl Variabel*   1 bis 10 Kopien
Reproduzierbarkeit Mittel*   Hoch
Multiplexing     ja
Vorgefertigte Assays     ja
Erfordert in der Regel Benutzerdesign, experimentelle Optimierung ja    
Genexpression Niedriges Quantifizierungsniveau   Hohes Quantifizierungsniveau
Anwendungen Genexpression
DNA-Quantifizierung (Pathogennachweis)
CHiP
  Genexpression
DNA-Quantifizierung
CHiP
SNP-Genotypisierung
Kopienzahlvariation
Pathway-Analyse
microRNA und kleine RNAs
Mutationsnachweis
Proteinanalyse
Multiplexing
  SYBR Green Primer

SYBR Green Mastermixe

  TaqMan Assays

TaqMan Mastermixe

*Je nach Template-Qualität und Primer-/Design-Optimierung.

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Abbildung 1: Vergleich der Arbeitsabläufe für den Nachweis mittels TaqMan und mittels SYBR Green.

TaqMan Chemie

Hintergrund

Ursprünglich wurden interkalierende Farbstoffe zur Messung von Produkten der Real-Time PCR verwendet. Der Hauptnachteil dieser Farbstoffe besteht darin, dass sie sowohl die Anreicherung spezifischer als auch unspezifischer PCR-Produkte erkennen.

Entwicklung der TaqMan Chemie

Echtzeit-Systeme für die PCR wurden durch die Einführung von fluorogenmarkierten Sonden verbessert, die die 5'-Nukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase verwenden. Die Verfügbarkeit dieser fluorogenen Sonden ermöglichte die Entwicklung einer Echtzeitmethode zur ausschließlichen Erkennung spezifischer Amplifikationsprodukte.

Schritt-für-Schritt-Prozess

 

  1. Eine Oligonukleotidsonde ist mit einem fluoreszierenden Reporter-Farbstoff am 5'-Ende und einem Quencher-Farbstoff am 3'-Ende ausgestattet. Bei intakter Sonde führt die räumliche Nähe des Quencher-Farbstoffs zum Reporter-Farbstoff durch den Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) zu einer starken Verringerung Fluoreszenz, die Reporter-Farbstoff emittiert wird.
  2. Wenn die Zielsequenz vorhanden ist, hybridisiert die Sonde unterhalb einer der Primerstellen und wird während der Primerverlängerung durch die 5'-Nukleaseaktivität der Taq -DNA-Polymerase gespalten.
  3. Diese Spaltung der Sonde:
    - trennt den Reporter-Farbstoff vom Quencher-Farbstoff und erhöht so das Signal des Reporter-Farbstoffs,
    - entfernt die Sonde aus dem Zielstrang, sodass die Primerverlängerung bis zum Ende des Template-Strangs fortgesetzt werden kann. Die Einbeziehung der Sonde hemmt somit nicht den gesamten PCR-Prozess.
  4. Mit jedem Zyklus werden zusätzliche Moleküle des Reporter-Farbstoffs von ihren jeweiligen Sonden abgespalten, wodurch sich die Fluoreszenzintensität proportional zur Menge des erzeugten Amplikons erhöht.
 


Bild

Abbildung 2: Überblick über die Assay-Chemie basierend auf TaqMan Sonden.

Zwei Arten von TaqMan Sonden

Wir bieten zwei Arten von Applied Biosystems™ TaqMan® Sonden an:

  • TaqMan Sonden (mit TAMRA™ Farbstoff als Quencher)
  • TaqMan® MGB-Sonden

TaqMan MGB-Sonden werden für Assays zur allelischen Diskriminierung empfohlen

Wir empfehlen generell die Verwendung von TaqMan MGB-Sonden für Assays zur allelischen Diskriminierung, insbesondere wenn die Länge herkömmlicher TaqMan Sonden 30 Nukleotide überschreitet. TaqMan MGB-Sonden enthalten:

  • einen nicht fluoreszierenden Quencher am 3'-Ende – die Geräte für die Real-Time PCR können die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffs genauer messen, da der Quencher nicht fluoresziert
  • einen Minor Groove Binder am 3'-Ende – der Minor Groove Binder bindet an die kleine DNA-Furche. Dies erhöht die Schmelztemperatur (Tm) der Sonden und ermöglicht so die Verwendung kürzerer Sonden

Folglich weisen die TaqMan MGB-Sonden größere Unterschiede bei den Tm-Werten zwischen übereinstimmenden und nicht übereinstimmenden Sonden auf, die eine genauere allelische Diskriminierung ermöglichen.

Vorteile der TaqMan Chemie

  • Die spezifische Hybridisierung zwischen Sonde und Ziel ist für die Erzeugung eines Fluoreszenzsignals erforderlich
  • Sonden können mit verschiedenen, unterscheidbaren Reporter-Farbstoffen markiert werden. Dies ermöglicht die Amplifikation und Erkennung von zwei eindeutigen Sequenzen in einem Reaktionsgefäß
  • Die Nachbearbeitung der PCR erübrigt sich, wodurch der Aufwand für den Assay und die Materialkosten verringert werden

Nachteile der TaqMan Chemie

Der Hauptnachteil ist, dass die Synthese unterschiedlicher Sonden für unterschiedliche Sequenzen erforderlich ist.

SYBR Chemie oder andere an doppelsträngige DNA bindende Farbstoffe

Hintergrund

Kleine Moleküle, die an doppelsträngige DNA binden, können in zwei Klassen eingeteilt werden:

  • Interkalatoren
  • Minor Groove Binder

Unabhängig von der Bindungsmethode muss ein DNA-bindender Farbstoff zum Echtzeitnachweis bei der PCR zwei Voraussetzungen erfüllen:

  • Erhöhte Fluoreszenz bei Bindung an doppelsträngige DNA
  • Keine Hemmung der PCR

Wir haben Bedingungen entwickelt, die die Verwendung des SYBR Green I Farbstoffs in der PCR mit geringer PCR-Hemmung und erhöhter Nachweisempfindlichkeit im Vergleich zu Ethidiumbromid ermöglichen. Darüber hinaus verfügen wir über neuere SYBR Green Farbstoffe, die heller fluoreszieren und die PCR weniger stark hemmen als das ursprüngliche SYBR Green I.

Funktionsweise der SYBR Farbstoffchemie

Der SYBR Farbstoff erkennt Produkte der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch Bindung an die während der PCR gebildete doppelsträngige DNA. So funktioniert es:

Schritt-für-Schritt-Prozess

  1. Wenn SYBR Farbstoff zu einer Probe hinzugefügt wird, bindet er sofort an jede doppelsträngige DNA in der Probe.
  2. Während der PCR amplifiziert die DNA-Polymerase die Zielsequenz und erzeugt so die PCR-Produkte.
  3. Der SYBR Farbstoff bindet dann an jede neue Kopie doppelsträngiger DNA.
  4. Während die PCR voranschreitet, wird mehr PCR-Produkt erzeugt. Der SYBR® Farbstoff bindet an jede doppelsträngige DNA und führt so zu einer Erhöhung des Fluoreszenzsignals proportional zur Menge des hergestellten PCR-Produkts.

Vorteile des SYBR Farbstoffs

  • Er kann zur Überwachung der Amplifikation jeder beliebigen Sequenz doppelsträngiger DNA eingesetzt werden.
  • Es ist keine Sonde erforderlich, wodurch die Kosten für Vorbereitung und Durchführung des Assays verringert werden können. Voraussetzungen sind ein gutes Primer-Design und eine gute Charakterisierung der Reaktion.

Nachteil des SYBR Farbstoffs

Der Hauptnachteil besteht darin, dass er möglicherweise falsch positive Signale erzeugt, denn aufgrund seiner Bindung an jede doppelsträngige DNA kann der SYBR Farbstoff auch an unspezifische doppelsträngige DNA-Sequenzen binden. Daher ist es äußerst wichtig, die Primer gut zu designen, damit sie keine Nicht-Zielsequenzen amplifizieren, und eine Schmelzkurvenanalyse durchzuführen.

Zusätzliche Erwägungen

Ein weiterer Aspekt bei der Verwendung von DNA-bindenden Farbstoffen ist, dass mehrere Farbstoffmoleküle an ein einzelnes amplifiziertes DNA-Molekül binden können. Eine Folge der Bindung mehrerer Farbstoffe ist, dass die Signalstärke von der Masse der doppelsträngigen DNA abhängt, die bei der Reaktion entsteht. Bei identischer Effizienz der Amplifikationen generiert die Amplifikation eines längeren Produkts daher mehr Signal als die eines kürzeren. Dies steht im Gegensatz zur Verwendung einer fluorogenen Sonde, bei der für jedes synthetisierte amplifizierte Molekül, unabhängig von dessen Länge, ein einzelner Fluorophor aus dem Quenching freigesetzt wird.