Hemos desarrollado dos tipos de composiciones químicas para detectar productos de PCR con instrumentos de PCR en tiempo real:

¿Qué sistema de PCR en tiempo real es adecuado para usted?

  Detección basada en SYBR Green   Detección basada en TaqMan
 
 
Utiliza colorante Applied Biosystems™ SYBR™ Green (un colorante de unión de ADN bicatenario) para detectar el producto de PCR conforme se acumula durante la PCR.
 
 
Utiliza una sonda fluorogénica específica del gen objetivo para detectar el objetivo conforme se acumula durante la PCR.
Especificidad Media*   Alta
Sensibilidad: n.º bajo de copias Variable*   1-10 copias
Reproducibilidad Media*   Alta
Multiplexing     sí
Ensayos prediseñados     sí
Requiere normalmente diseño del usuario y optimización experimental sí    
Expresión génica Nivel bajo de cuantificación   Nivel alto de cuantificación
Aplicaciones Expresión génica
Cuantificación de ADN (detección de patógenos)
CHiP
  Expresión génica
Cuantificación de ADN
CHiP
Identificación de genotipos de SNP
Variación del número de copias
Análisis de vía
microARN & ARN pequeños
Detección de mutaciones
Análisis de proteínas
Multiplexing
  Primers SYBR Green

Mezclas maestras SYBR Green

  Ensayos TaqMan

Mezclas maestras TaqMan

*Depende de la calidad de la plantilla y de la optimización de primers/diseño.

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Figura 1: Comparación de flujos de trabajos de detección basados en TaqMan y en SYBR Green.

Composición química TaqMan

Antecedentes

Inicialmente, se utilizaban colorantes de intercalador para medir productos de PCR en tiempo real. La principal desventaja de estos colorantes es que detectan la acumulación tanto de productos de PCR específicos como inespecíficos.

Desarrollo de la composición química TaqMan

Los sistemas en tiempo real para la PCR se mejoraron con la introducción de las sondas con marcación fluorogénica que utilizan la actividad de 5' nucleasa de la ADN polimerasa Taq. La disponibilidad de estas sondas fluorogénicas permitió el desarrollo de un método en tiempo real para la detección únicamente de productos de amplificación específicos.

Proceso paso a paso

 

  1. Se construye una sonda de oligonucleótidos que contiene un colorante fluorescente indicador en el extremo 5' y un colorante supresor en el extremo 3'. Mientras la sonda está intacta, la proximidad del colorante supresor reduce considerablemente la fluorescencia emitida por el colorante indicador mediante la transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET).
  2. Si la secuencia objetivo está presente, la sonda se recuece posteriormente desde uno de los sitios de primer y se disocia mediante la actividad de 5' nucleasa de la ADN polimerasa Taq conforme se amplía este primer.
  3. Esta disociación de la sonda:
    -- Separa el colorante indicador del colorante supresor, lo que aumenta la señal del colorante indicador.
    -- Retira la sonda de la cadena objetivo, lo que permite la ampliación del primer para continuar hasta el extremo de la cadena de plantilla. De esta forma, la inclusión de la sonda no inhibe el proceso general de la PCR.
  4. Las moléculas adicionales del colorante indicador se disocian de sus sondas correspondientes con cada ciclo, lo que permite un aumento de la intensidad de la fluorescencia proporcional a la cantidad de amplicones producida.
 


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Figura 2: Descripción general de la composición química del ensayo basado en sonda TaqMan.

Dos tipos de sondas TaqMan

Ofrecemos dos tipos de sondas Applied Biosystems™ TaqMan®:

  • Sondas TaqMan (con colorante TAMRA™ como colorante supresor)
  • Sondas TaqMan® MGB

Sondas TaqMan MGB recomendadas para ensayos de discriminación alélica

Se recomienda el uso general de las sondas TaqMan MGB para ensayos de discriminación alélica, especialmente cuando las sondas TaqMan convencionales superan los 30 nucleótidos. Las sondas TaqMan MGB contienen:

  • Un supresor no fluorescente en el extremo 3': los instrumentos de PCR en tiempo real pueden medir las contribuciones del colorante indicador de manera más precisa ya que el supresor no emite fluorescencia
  • Una unión al surco menor en el extremo 3': la unión al surco menor (Minor Groove Binder, MGB) aumenta la temperatura de fusión (Tm) de las sondas, lo que permite el uso de sondas más cortas

Por lo tanto, las sondas TaqMan MGB presentan mayores diferencias en los valores de Tm entre sondas coincidentes y no coincidentes, lo que proporciona una discriminación alélica más precisa.

Ventajas de la composición química TaqMan

  • Es necesaria una hibridación específica entre la sonda y el objetivo para generar la señal fluorescente
  • Las sondas se pueden marcar con diferentes colorantes indicadores distinguibles, lo que permite la amplificación y la detección de dos secuencias diferentes en un solo tubo de reacción
  • Se elimina el procesamiento posterior a la PCR, lo que reduce los costes de material y mano de obra del ensayo

Desventajas de la composición química TaqMan

La principal desventaja es que es necesaria la síntesis de sondas diferentes para secuencias diferentes.

Composición química SYBR u otros colorantes de unión a ADN bicatenario

Antecedentes

Las moléculas pequeñas que se unen a ADN bicatenario se pueden dividir en dos clases:

  • Intercaladores
  • Uniones al surco menor

Independientemente del método de unión, existen dos requisitos para un colorante de unión a ADN para la detección en tiempo real de la PCR:

  • Aumento de fluorescencia al unirse a ADN bicatenario
  • Sin inhibición de la PCR

Hemos desarrollado condiciones que permiten el uso del colorante SYBR Green I en la PCR con poca inhibición de la PCR y mayor sensibilidad de detección en comparación con el bromuro de etidio. Además, contamos con los nuevos colorantes SYBR Green que emiten una fluorescencia más brillante e inhiben la PCR menos que el SYBR Green I original.

Cómo funciona la composición química del colorante SYBR

El colorante SYBR Green detecta productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante la unión a ADN bicatenario formado durante la PCR. Veamos cómo funciona:

Proceso paso a paso

  1. Cuando se añade el colorante SYBR a una muestra, se une inmediatamente a todo el ADN bicatenario presente en esta.
  2. Durante la PCR, la ADN polimerasa amplifica la secuencia objetivo lo que crea los productos de PCR.
  3. A continuación, el colorante SYBR se une a cada nueva copia de ADN bicatenario.
  4. Conforme avanza la PCR, se crea más producto de PCR. El colorante SYBR® se une a todo el ADN bicatenario, por lo que el resultado es un aumento de la intensidad de la fluorescencia proporcional a la cantidad de producto de PCR producido.

Ventajas del colorante SYBR Green

  • Se puede utilizar para controlar la amplificación de cualquier secuencia de ADN bicatenario.
  • No es necesaria ninguna sonda, lo que puede reducir los costes de funcionamiento y configuración de ensayos, siempre que su primers de PCR estén bien diseñados y su reacción esté bien caracterizada.

Desventaja del colorante SYBR Green

La principal desventaja es que puede generar señales de falsos positivos, es decir, puesto que el colorante SYBR se une a cualquier ADN bicatenario, también se une a secuencias de ADN bicatenario inespecíficas. Por lo tanto, es extremadamente importante contar con primers bien diseñados que no amplifiquen secuencias no objetivo y realizar un análisis de curva de fusión.

Consideración adicional

Otro aspecto de utilizar colorantes de unión a ADN es que varias moléculas de colorante se unen a una única molécula de ADN amplificada. Una consecuencia de la unión de múltiples colorantes es que la cantidad de señal depende de la masa del ADN bicatenario producido en la reacción. Por lo tanto, si las eficacias de la amplificación son las mismas, la amplificación de un producto de mayor longitud generará más señal que uno de menor longitud. Este método es opuesto al uso de una sonda fluorogénica, en el que se libera un único fluoróforo de la supresión para cada molécula amplificada sintetizada, independientemente de su longitud.