Détectez simultanément l’ARN et les protéines par cytométrie en flux

La cytométrie en flux, grâce à sa capacité pour acquérir et analyser simultanément des millions de cellules individuelles, utiliser les capacités de multiplexage et détecter à la fois la surface cellulaire et les protéines intracellulaires dans un flux de travail simple est devenue depuis longtemps la norme pour caractériser les populations cellulaires hétérogènes. Néanmoins, la cytométrie en flux a été limitée par la disponibilité et l’adéquation des anticorps pour mesurer tous les analytes d’intérêt. Les micro-ARN et l’ARN long non codant, l’ARN messager, les transcrits viraux, les organismes modèles uniques et les cibles pour lesquelles le développement d’anticorps est problématique n’ont pu utiliser la puissance de la cytométrie en flux. Ils ont historiquement exigé que les chercheurs conduisent de nombreuses expériences déconnectées pour analyser ces systèmes cellulaires.

Grâce à Invitrogen™ PrimeFlow™ RNA Assay, les chercheurs peuvent maintenant révéler la dynamique de l’expression d’ARN et de protéines simultanément dans des millions de cellules uniques. Ce nouveau dosage utilise l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) avec la puissance d’une technique d’amplification d’ADN ramifié (bDNA) pour la détection simultanée d’un maximum de quatre cibles d’ARN en combinaison avec l’immunophénotypage pour la surface cellulaire et les protéines intracellulaires en utilisant des anticorps conjugués aux fluorochromes. Les données sont recueillies en utilisant un cytomètre en flux standard.

Le flux de travail du PrimeFlow RNA Assay.

 

Présentation de la technologie

Le PrimeFlow RNA Assay basé sur la technologie de l’ADN ramifié, sert pour amplifier la détection d’un transcrit d’ARN, plutôt que l’ARN cible lui-même. Le PrimeFlow RNA Assay peut détecter l’ARNm, l’ARN long non codant et les microARN, ainsi que l’ARN viral et l’ADN des télomères. La détection des microARN est optimale lorsque l’on utilise Invitrogen™ PrimeFlow™ microRNA Pretreatment Buffer (réf. 88-18006) et le protocole. Dans la première étape d’hybridation du dosage, un ensemble de sondes cibles d’oligonucléotides propres aux gènes qui contient 20 à 40 paires de sondes (ou une unique paire dans le cas d’ensembles de sondes pour microARN) se lie à la séquence d’ARN cible. Une paire de sondes individuelles est conçue pour se lier l’une à l’autre pour que l’amplification du signal ait lieu. L’amplification du signal est alors obtenue lors d’une série d’étapes d’hybridation séquentielles. Les molécules de préamplificateur confèrent un niveau de spécificité supplémentaire parce qu’elles s’hybrident aux sondes de cible seulement lorsque les deux moitiés d’une paire de sondes respectives sont liées à leur séquence cible. Les molécules d’amplificateur multiples s’hybrident par la suite avec leur préamplificateur respectif.

Pour finir, les oligonucléotides de la sonde de marquage conjugués à un colorant fluorescent s’hybrident à leurs molécules d’amplificateur correspondantes. Un "arbre" d’amplification de signal totalement assemblé comporte 400 sites de liaison Label Probe. Lorsque toutes les sondes d’oligonucléotides propres aux cibles dans le Target Probe se lient au transcrit d’ARN cible, on obtient une amplification de 8 000 à 16 000 fois.

Nous proposons actuellement quatre structures d’amplification uniques qui permettent la mesure simultanée d’un maximum de quatre cibles différentes d’ARN pour l’analyse de cytométrie en flux multicolore. Quatre types de sondes sont actuellement disponibles pour permettre la détection de l’ARN marqué avec Alexa Fluor 647 (ensembles de sondes de type 1), Alexa Fluor 488 (ensembles de sondes de type 4) ou Alexa Fluor 568 (ensembles de sondes de type 10). Lors de la détection de plus d’une cible d’ARN dans un seul échantillon, chaque ensemble de sondes doit être d’un type unique pour différencier son signal des autres. Une fois que les cellules ont été traitées par le PrimeFlow RNA Assay, les données peuvent être recueillies et analysées sur n’importe quel cytomètre en flux standard. Le schéma ci-dessus illustre la détection de deux cibles uniques.

Recherchez les ensembles de sondes disponibles (en stock)

Kits de dosage et produits connexes

Ce PrimeFlow RNA Assay contient tous les réactifs nécessaires pour réaliser le dosage. Les sondes de contrôle positives et les sondes cibles pour les gènes d’intérêt sont vendues séparément.

Principales publications

  1. Baxter AE, Niessl J, Fromentin R et al (2016) Single-cell characterization of viral translation-competent reservoirs in HIV-infected individuals. Cell Host Microbe 20(3):368–380.

  2. Soh KT, Tario JD Jr, Colligan S et al (2016) Simultaneous, single-cell measurement of messenger RNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Curr Protoc Cytom 75:7.45.1–7.45.33.

  3. Shalapour S, Font-Burgada J, Di Caro G et al (2015) Immunosuppressive plasma cells impede T-cell-dependent immunogenic chemotherapy. Nature 521(7550):94–98.

  4. Wojno ED, Monticelli LA, Tran SV et al (2015) The prostaglandin D2 receptor CRTH2 regulates accumulation of group 2 innate lymphoid cells in the inflamed lung. Mucosal Immunol 8(6):1313–1323.

  5. Porichis F1, Hart MG2, Griesbeck M et al (2014) High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun 5:5641.
    Voir le séminaire en ligne connexe

Ressources

Séminaires en ligne

Assistance

 

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.