Dosages sur microplaques par fluorescence

Instructions d’optimisation des dosages sur microplaques basés sur la fluorescence

1. Sélectionnez les filtres ou les longueurs d’onde d’émission et d’excitation de fluorescence optimaux. Les données correspondant aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont indiquées dans le manuel d’utilisation du produit et / ou les fiches d’examen rapide. Une mauvaise correspondance spectrale entre les réactifs de détection et les instruments peut provoquer d’importantes pertes de signal.
2. Ajustez les paramètres de sensibilité de l’instrument pour optimiser le signal de fluorescence. Pour atteindre l’échelle dynamique linéaire maximale, sélectionnez le paramètre de gain ou de sensibilité le plus élevé qui convient à la fois aux valeurs de dosage minimale et maximale prévues.
3. Utilisez des volumes de dosage uniformes. Une différence de volume de dosage même minime peut provoquer d’importantes différences de signal. Pour obtenir des mesures fiables, utilisez au moins le volume minimal recommandé par le fabricant de l’instrument.
4. Mélangez soigneusement les échantillons. Un mélange insuffisant peut entraîner une agrégation, une précipitation et des variations des taux de réaction, ou encore des différences de concentration d’analytes ou du réactif de détection entre les puits.
5. Évitez toute formation de bulles. La présence de bulles dans des solutions de dosage provoque une diffusion de lumière et des signaux incorrects. Centrifugez brièvement la microplaque, éliminez les gaz des solutions avant de procéder à la distribution (sauf pour ce qui concerne les dosages pour cellules vivantes) ou éclatez les grandes bulles à l’aide d’un embout de pipette.
6. Préparez des échantillons répliqués. L’analyse de réplicats améliore la précision des mesures.
7. Évitez tout “effet de bord”. Une solution de fluorophore adapté sur le plan spectral peut être utilisée pour déterminer la constance du signal de fluorescence obtenu dans tous les puits de la microplaque. Si des différences de signal sont observées dans les puits, sur les bords de la microplaque, appliquez un facteur d’étalonnage approprié ou n’utilisez pas ces puits.
8. Séparez les échantillons brillants. Dans des microplaques transparentes, les échantillons très fluorescents peuvent affecter les signaux observés dans les puits adjacents (diaphonie entre les puits). Ne remplissez pas les puits situés à côté d’échantillons hautement fluorescents ou chargez les échantillons avec des intensités de fluorescence similaires dans les puits voisins. Utilisez des microplaques à parois blanches ou noires, pas des plaques transparentes.
   
9. Évitez de photoblanchir les échantillons. Ne réanalysez pas les échantillons, sauf en cas de nécessité absolue. Ne réanalysez pas les étalons car un photoblanchiment important peut se produire avec certains réactifs au cours des mesures de fluorescence.
10. Utilisez des concentrations d’échantillons comprises dans la plage prévue pour le dosage. En présence d’échantillons inconnus, essayez de procéder à plusieurs dilutions.