Digestion par enzymes de restriction et modification de l’ADN
Le clonage par ligature et digestion par enzymes de restriction est une méthode permettant de déplacer simplement un fragment d’ADN bicaténaire d’un plasmide à un autre.
Pour cela, commencez par :
- Choisir les enzymes de restriction dont les séquences de reconnaissance flanquent le gène qui vous intéresse
- Incuber la réaction pendant la durée recommandée
- Purifier votre fragment
- Le ligaturer dans le plasmide qui vous intéresse
Système de clonage par enzymes de restriction Invitrogen™ Anza™
Un système d’enzymes de restriction et d’enzymes de modification de l’ADN complet pour un clonage en toute simplicité.
- Un tampon unique pour toutes les enzymes de restriction
- Un protocole de digestion unique pour tous les types d’ADN
- Digestion effectuée en 15 minutes
- Digestion complète en une nuit sans aucune activité Star
Enzymes de restriction
Un protocole simple en deux étapes, quel que soit le nombre d’enzymes de restriction au sein de votre réaction ou le type d’ADN que vous utilisez. Il vous suffit de préparer votre mélange de réaction et de l’incuber à 37 °C pendant 15 minutes.
Enzymes de modification de l’ADN
Tampon Anza
Enzymes de restriction traditionnelles
Les enzymes de restriction agissent en coupant l’ADN bicaténaire selon des séquences de reconnaissance à répétition inversée de 4 à 8 paires de base spécifiques. Les produits du clivage d’ADN ont deux types d’extrémités : franches ou saillantes de type 5’ ou 3’.
Enzymes de modification de l’ADN
Ligases
Quel que soit le type d’extrémité généré dans le cadre d’une digestion par des enzymes de restriction, le clivage de l’ADN produit toujours des fragments dont les terminaisons comportent des groupes d’hydroxyle-3’ et de phosphate-5’. La ligase d’ADN connecte par covalence des terminaisons de phosphates-5’ et d’hydroxyle-3’ d’ADN (ou ARN) duplex en une réaction dépendante de l’APT.
Phosphatase alcaline
La phosphatase alcaline hydrolyse les phosphates-3’ et 5’ de l’ADN et de l’ARN. Cette réaction permet d’éliminer les phosphates-5’ avant de procéder au marquage final et de déphosphoryler les vecteurs avant d’insérer la ligature. Elle peut également être utilisée pour déphosphoryler les protéines.
Réparation des extrémités
La réparation des extrémités permet de convertir de l’ADN à saillies de 5’ ou 3’ en ADN à extrémités franches phosphorylées de 5’ afin d’obtenir une ligature efficace en vecteurs de clonage à extrémités franches.
Polynucléotide kinase
La polynucléotide kinase permet d’effectuer la phosphorylation de l’extrémité 5’ de l’ADN et des oligonucléotides. Lors de la préparation de l’ADN pour l’étape de ligature du clonage, l’ADN d’insert ou l’ADN vectoriel doit contenir un phosphate 5’. En général, l’ADN amplifié par PCR est traité avec une PNK T4 afin d’effectuer la phosphorylation de l’extrémité 5’ pour la ligature suivante du clonage.
Coupe franche d’ADN
Les kits de coupe franche d’ADN permettent de convertir l’ADN à extrémités cohésives en ADN à extrémités franches, utilisable dans les réactions des ligatures d’extrémités franches. Ce processus est utile lorsque le vecteur voulu ne contient pas de site de reconnaissance produisant des extrémités franches.
Polymérases
Les polymérases permettent de générer des extrémités franches et/ou d’incorporer de l’ADN marqué.
- ADN polymérases
- Reportez-vous à la liste complète d’enzymes de modification de l’ADN
Centre d’assistance pour le clonage
Conseils, aide au dépannage et ressources pour vos applications de clonage
Formation au clonage
Découvrez les fondements du clonage moléculaire et de la technologie recombinante