Nous avons développé deux types de chimie pour détecter les produits de PCR à l’aide d’instruments de PCR en temps réel :

Quelle chimie en temps réel vous convient le mieux ?

  Détection basée sur SYBR Green   Détection basée sur TaqMan
 
 
Utilise le colorant Applied Biosystems™ SYBR™ Green (un colorant se liant à l’ADNdb) pour détecter le produit de PCR au fur et à mesure qu’il s’accumule au cours de la PCR.
 
 
Utilise une sonde fluorogénique spécifique au gène cible pour détecter la cible au fur et à mesure qu’elle s’accumule au cours de la PCR.
Spécificité Moyenne*   Élevée
Sensibilité : faible nombre de copies Variable   1 à 10 copies
Reproductibilité Moyenne*   Élevée
Multiplexage     oui
Dosages préconçus     oui
Nécessite en général que l’utilisateur se charge de la conception, en recourant à une optimisation expérimentale oui    
Expression génétique Faible niveau d’analyse quantitative   Haut niveau d’analyse quantitative
Applications Expression génétique
Analyse quantitative de l’ADN (détection d’agents pathogènes)
CHiP
  Expression génétique
Analyse quantitative de l’ADN
CHiP
Génotypage SNP
Variation du nombre de copies
Analyses des voies
micro-ARN et petits ARN
Détection de mutations
Analyse protéique
Multiplexage
  Amorces SYBR Green

Master Mix SYBR Green

  Dosages TaqMan

Master Mix TaqMan

*Dépend de la qualité de la matrice et de l’optimisation de l’amorce/de la conception.

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Figure 1 : Comparaison des flux de travaux de détection basée sur TaqMan et des flux de travaux de détection basée sur SYBR Green

Chimie TaqMan

Bruit de fond

Avant, les colorants intercalants étaient utilisés pour mesurer les produits de PCR en temps réel. Le principal inconvénient de ces colorants est qu’ils détectent l’accumulation de produits de PCR spécifiques et non spécifiques.

Développement de la chimie TaqMan

Les systèmes en temps réel pour PCR ont été améliorés par l’introduction de sondes marquées par fluorescence qui utilisent l’activité des nucléases 5’ de l’ADN polymérase Taq. La disponibilité de ces sondes fluorogéniques a permis d’élaborer une méthode en temps réel pour détecter uniquement des produits d’amplification spécifiques.

Un processus étape par étape

 

  1. Une sonde d’oligonucléotides est élaborée, contenant un colorant fluorescent rapporteur au niveau de l’extrémité 5’ et un colorant absorbeur au niveau de l’extrémité 3’. Tant que la sonde est intacte, la proximité du colorant absorbeur réduit fortement la fluorescence émise par le colorant rapporteur lors du transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET).
  2. Si la séquence cible est présente, la sonde s’hybride en aval de l’un des sites d’amorce et est clivée par l’activité des nucléases 5’ de l’ADN polymérase Taq au fur et à mesure que cette amorce est étendue.
  3. Ce clivage de la sonde :
    -- sépare le colorant rapporteur du colorant absorbeur, augmentant ainsi le signal du colorant rapporteur.
    -- provoque le retrait de la sonde du brin cible, permettant à l’extension des amorces de continuer jusqu’à la fin du brin matrice. Ainsi, l’inclusion de la sonde n’inhibe pas le processus global de PCR.
  4. Les molécules du colorant rapporteur supplémentaires sont clivées de leurs sondes respectives avec chaque cycle, ce qui entraîne une augmentation de l’intensité de la fluorescence proportionnelle à la quantité d’amplicons produite.
 


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Figure 2 : Présentation de la chimie de dosage basée sur une sonde TaqMan.

Deux types de sondes TaqMan

Nous offrons deux types de sondes Applied Biosystems™ TaqMan® :

  • les sondes TaqMan (avec un colorant TAMRA™ comme colorant absorbeur)
  • Sondes MGB TaqMan®

Sondes MGB TaqMan recommandées pour les dosages de discrimination allélique

Nous recommandons d’utiliser principalement des sondes MGB TaqMan pour les dosages de discrimination allélique, en particulier lorsque les sondes TaqMan classiques contiennent plus de 30 nucléotides. Les sondes MGB TaqMan contiennent :

  • un extincteur non fluorescent au niveau de l’extrémité 3’ ; les instruments de PCR en temps réel peuvent mesurer plus précisément les contributions du colorant rapporteur, car l’extincteur n’est pas fluorescent
  • un liant au sillon mineur (MGB) au niveau de l’extrémité 3’ ; le liant au sillon mineur augmente la température de fusion des sondes, permettant l’utilisation de sondes plus courtes

Par conséquent, les sondes MGB TaqMan présentent une plus grande différence de valeurs de température de fusion entre les sondes appariées et les sondes mal appariées, ce qui permet une discrimination allélique plus précise.

Avantages de la chimie TaqMan

  • L’hybridation spécifique entre la sonde et la cible est nécessaire pour générer un signal fluorescent
  • Les sondes peuvent être marquées avec des colorants rapporteurs différents et faciles à distinguer, ce qui permet l’amplification et la détection de deux séquences distinctes dans un tube de réaction
  • Plus besoin de traitement post-PCR, ce qui réduit les coûts de main-d’œuvre et de matériel

Inconvénients de la chimie TaqMan

Le principal inconvénient est que la synthèse des différentes sondes est requise pour des séquences différentes.

Chimie SYBR ou autres colorants se liant à l’ADN double brin

Bruit de fond

Les petites molécules qui se lient à l’ADN double brin peuvent être divisées en deux catégories :

  • les intercalants
  • les liants au sillon mineur

Indépendamment de la méthode de liaison, ils existent deux exigences pour un colorant se liant à l’ADN pour la détection en temps réel de la PCR :

  • une fluorescence accrue lors d’une liaison à de l’ADN double brin
  • pas d’inhibition de la PCR

Nous avons développé des conditions qui permettent l’utilisation du colorant SYBR Green I pour la PCR avec peu d’inhibition de la PCR et une augmentation de la sensibilité de détection par rapport au bromure d’éthidium. De plus, nous avons de tout nouveaux colorants SYBR Green qui émettent une fluorescence plus brillante et inhibent moins la PCR par rapport au colorant SYBR Green I original.

Fonctionnement de la chimie de colorant SYBR

Le colorant SYBR détecte les produits de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) en se liant à l’ADN double brin formé au cours de la PCR. Le fonctionnement :

Un processus étape par étape

  1. Lorsque le colorant SYBR est ajouté à un échantillon, il se lie immédiatement à tous les ADN double brin présents dans l’échantillon.
  2. Au cours de la PCR, l’ADN polymérase amplifie la séquence cible, ce qui crée les produits de PCR.
  3. Le colorant SYBR se lie ensuite à chaque nouvelle copie d’ADN double brin.
  4. Au fur et à mesure que la PCR progresse, d’autres produits de PCR sont créés. Le colorant SYBR® se liant à tous les ADN double brin, l’intensité de fluorescence augmente proportionnellement à la quantité de produits de PCR générés.

Avantages du colorant SYBR

  • Il peut être utilisé pour suivre l’amplification de n’importe quelle séquence d’ADN double brin.
  • Aucune sonde n’est requise, ce qui peut réduire la configuration du dosage et les coûts de fonctionnement, en supposant que vos amorces pour PCR sont bien conçues et que votre réaction est bien caractérisée.

Inconvénient du colorant SYBR

Le principal inconvénient est que ce colorant peut générer de faux signaux positifs ; en effet, comme le colorant SYBR se lie à n’importe quel ADN double brin, il peut aussi se lier à des séquences d’ADN double brin non spécifiques. Par conséquent, il est extrêmement important d’avoir des amorces bien conçues qui n’amplifient pas les séquences non-cibles et que l’analyse de la courbe de fusion soit effectuée.

Autres considérations

Un autre aspect de l’utilisation de colorants se liant à l’ADN est que plusieurs molécules de colorant peuvent se lier à une seule molécule d’ADN amplifiée. Une conséquence de la liaison des colorants multiples est que l’intensité du signal dépend de la masse de l’ADN double brin produit dans la réaction. Ainsi, si l’efficacité des amplifications est la même, l’amplification d’un produit plus long va générer un signal plus intense qu’un produit plus court. Cela diffère beaucoup de l’utilisation d’une sonde fluorogénique, dans laquelle un seul fluorophore est libéré par absorption pour chaque molécule amplifiée synthétisée, indépendamment de sa longueur.