Serial Block-Face Imaging für die Volumenelektronenmikroskopie

Das Wissen über die komplexe 3D-Architektur von Zellen und Geweben in ihrem natürlichen Kontext ist entscheidend für die Korrelation von Struktur und Funktion in biologischen Systemen. In den letzten Jahren gab es erhebliche Fortschritte bei den REM-basierten Methoden zur 3D-Rekonstruktion großer Gewebevolumina. Die Serial-Block-Face-REM (SBF-REM) kombiniert den In-situ-Schnitt mit der Bildgebung von in Kunststoff eingebetteten Gewebeblöcken innerhalb der REM-Vakuumkammer auf vollautomatische Weise zur Rekonstruktion großer Gewebevolumina. Bisher war die axiale Auflösung durch die Mindestdicke der Scheibe, die von der Blockfläche abgeschnitten werden konnte, begrenzt. Doch dank der Kombination von SBF-REM und Multienergie-Dekonvolution-REM (MED-REM) können nun mit dem Thermo Scientific Volumescope 2 REM große Volumen mit echter isotroper 3D-Auflösung abgebildet werden.

Beim Serial Block-Face Imaging wird zuerst die Oberfläche einer in Harz eingebetteten Gewebeprobe mit dem Elektronenstrahl gescannt und eine 2D-Aufnahme der Probe erstellt.

Anschließend wird diese obere Fläche mit einem In-situ-Mikrotom entfernt. Die Dicke jedes Schnitts ist benutzerdefiniert, liegt jedoch in der Regel über 15 bis 20 µm. Nach der Verwendung wird der Schnitt in einer Abfallsammelvorrichtung entsorgt.

Anschließend wird mit der REM eine Aufnahme der frischen Oberfläche gemacht. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis die gesamte Probe abgebildet wurde; die Gesamthöhe der Probe kann zehn bis mehrere hundert Mikrometer oder mehr betragen. Der serielle Bildstapel wird dann mit einer 3D-Rendering-Software verarbeitet.

Der Prozess des Serial Block-Face Imaging kann optimiert und verfeinert werden, um spezifischen Anforderungen des Anwenders oder der Probe gerecht zu werden, einschließlich lokalisierter Untersuchungsbereiche, mehrerer Bereiche oder verschiedener Bildgebungsdetektoren.

Die Multienergie-Dekonvolution-REM (MED-REM) ist eine neuartige Methode zur Verbesserung der axialen Auflösung durch die Kombination mechanischer Schnitte mit einer optischen Schnittdarstellung. Nach dem In-situ-Schnitt der Blockfläche mit einem Diamantmesser wird das freigelegte Gewebe mit zunehmender Beschleunigungsspannung mehrmals abgebildet. Diese Bilder werden anschließend in einem Dekonvolutionsalgorithmus verwendet, um mehrere optische Untergrundschichten abzuleiten, die eine 3D-Untergruppe bilden. Durch Wiederholung dieses Zyklus liefert das Volumescope 2 REM isotrope Datensätze mit einer z-Auflösung von 10 nm.

Standardisiertes Protokoll, das die Thermo Scientific Amira Visualisierungssoftware zur Quantifizierung von Organellenmorphologien in 3D nutzt, wodurch genaue und reproduzierbare Messungen dieser zellulären Unterstrukturen ermöglicht werden. Das Protokoll wurde mit SBF-REM und der Amira Software zur Quantifizierung von Mitochondrienstrukturen und Strukturen des endoplasmatischen Retikulums (ER) ausgeführt.

„Früher habe ich im Internet gesurft. Jetzt surfe ich in Datensätzen. Das Dogma der Zellbiologie lautet: Struktur ist Funktion.“

Prof. Jeffrey Salisbury von der Mayo Clinic spricht über seine mehr als 45-jährige Erfahrung in der Mikroskopie und beantwortet verschiedene biologische Fragen. Dazu gehören auch jüngste 3D-Untersuchungen mit Serial Block-Face Imaging, um die 3D-Architektur verschiedener Gewebe-, Nieren- und Gehirnproben in normalem und krankem Zustand zu untersuchen.

„Es ist eine unglaublich spannende Zeit, in der wir endlich die Möglichkeit haben, echte zellbiologische Forschung zu betreiben. Ich habe jahrelang darauf gewartet und kann es jetzt kaum erwarten, damit zu arbeiten.“

Christopher Gilpin, Direktor des Purdue Electron Microscopy Center, erörtert das Serial Block-Face Imaging und seine mögliche Verwendung zur biologischen Multiskalen-Zuordnung im Kontext von 3D-Bildgebungsverfahren.