Lipofectamine Stem Transfection Reagent

多能性幹細胞（PSC）および神経幹細胞（NSC）で 80％ まで、間葉系幹細胞（MSC）で 45% までのトランスフェクション効率を達成

• 高い汎用性:DNA（11 kb まで）、RNA、Cas9 タンパク質複合体のコトランスフェクションが可能
• 細胞に優しい:低毒性で、分化を誘導することなく細胞の増殖を維持
• フレキシブル:フォワード法、リバース法どちらのトランスフェクションにも対応

図 1.Essential 8 培地およびビトロネクチンで培養し、1 µL の Lipofectamine Stem 試薬と GFP 発現コンストラクトの複合体 (500 ng のトータルプラスミド DNA) を用いてトランスフェクションしたヒト ES 細胞 (H9) をタイムラプス撮影した位相コントラスト (左) および蛍光 (右) 動画。培養細胞をトランスフェクション開始から 48 時間にわたって観察。

幹細胞のトランスフェクションは、多くの研究者にとって重要な技術ですが、幹細胞は感受性が高いため、試薬ベースのプロトコルを用いて効率のよいトランスフェクションを行うことは困難とされてきました。トランスフェクション効率を大幅に改善すべくデザインされた Invitrogen Lipofectamine Stem Transfection Reagent は、DNA、RNA、Cas9/gRNA などの RNP を多能性幹細胞や神経幹細胞、間葉系幹細胞など幅広い幹細胞に導入する、簡便で信頼性の高い再現可能な方法を提供します(図 2) 。Lipofectamine トランスフェクション試薬シリーズに新たに 加わった本製品は、最大限の細胞生存率と未分化状態での増殖を維持しながら、高効率のトランスフェクションを実現します。

ゲノム編集、遺伝子発現、分化誘導などの研究アプリケーションでは、DNA、RNA および/または Cas9 タンパク質複合体を幹細胞に効果的に、効率よく導入できるかどうかが大変重要です。大きなコンストラクトをともなう実験では、試薬を用いたトランスフェクションでは良好な結果を得ることが難しく、従来エレクトロポレーション法が用いられてきました。Lipofectamine Stem 試薬は、幹細胞のトランスフェクションにおいてより向上した能力を発揮し、11 kb までの DNA プラスミドの導入を可能にしています。ゲノム編集では、Lipofectamine Stem 試薬を用いることで、Cas9 タンパク質とガイド RNA の複合体、および相同組換え修復を行うための一本鎖 DNA を コトランスフェクションする ことが可能です。さらに、Lipofectamine Stem 試薬は、幹細胞を用いた遺伝子 発現 あるいは分化誘導研究において、mRNA のトランスフェクションにも使用できます。このような特長をもつ汎用性の高い本製品は、幹細胞研究の理想的なツールとして、エレクトロポレーションに代わって容易にお使いいただける選択肢を提供します。

幹細胞のトランスフェクションでは、未分化状態を維持したまま細胞が継続的に増殖する培養条件を保つことが重要です。外因性コンストラクトの導入によって、予期したおよび予期せぬ結果が生じることがありますが、Lipofectamine Stem は細胞の増殖に悪影響を与えません (図 5)。

多能性幹細胞の培養システムには、フィーダー培養やフィーダーフリー培養など多くの選択肢があり、さまざまなマトリックスが使用されています。Lipofectamine Stem は、さまざまな培養システムと併せて使用することができます。お使いの培養システムで、トランスフェクション効率を最大化するためのヒントを以下にいくつかご紹介します:

1. 多能性幹細胞を細胞塊として継代し、フィーダー上あるいは Geltrex マトリックス上で大きなコロニーとして増殖させる場合、継代時に浮遊状態でトランスフェクションを行い、再播種することで、試薬がすべての細胞に最大限に行き渡り、トランスフェクション効率を向上させることができます。この方法は、単層培養システムでも用いることができ、均一で高いトランスフェクション効率が得られます。あるいはエレクトロポレーションに代わる選択肢となります。
2. Geltrex あるいは Matrigel マトリックス上で増殖させた接着細胞をトランスフェクションする場合は、小さな細胞塊あるいは単一の多能性幹細胞を最適な 30–60% の密度でプレーティングし、24～48 時間のトランスフェクション中も細胞が続けて増殖できるようにすることが重要です。
3. 接着細胞をトランスフェクションする場合は、ビトロネクチンあるいはラミニン上で細胞を増殖させることで、細胞がより単層で広がり、トランスフェクション効率を最大化できます。
4. Lipofectamine Stem はほとんどの培養システムに適合しますが、一部の幹細胞用培地の成分はリポソームベースのトランスフェクションを妨げることがあります。そのような場合は、 Opti-MEM 培地を トランスフェクションの最初の 1～4 時間で用いてから、使用したい培地を添加することで、増殖を引き続き維持しながら、干渉の影響を最小限に抑えることができます。詳細は  Lipofectamine Stem Transfection Reagent ユーザーガイド をご参照ください。

 Lipofectamine Stem Transfection Reagent ユーザーガイド 用に作成したプロトコルに加えて、幹細胞に特化したプロトコルもご用意しています。異なる種類の幹細胞 (ES細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞) と選択した培地を用いて、低毒性で高いトランスフェクション効率を得るためのガイドとしてご活用ください。 プロトコルは、細胞増殖、培養条件、継代から、成功するトランスフェクション法までを包括的に網羅しています。