制限酵素の消化とライゲーション

制限酵素消化とライゲーションによるクローニングは、二本鎖 DNA のフラグメントを特定のプラスミドから別のプラスミドに移動するためのシンプルかつ簡単な方法です。

開始方法:

Anza™ 制限酵素クローニングシステム

制限酵素および DNA 修飾酵素の完全なシステム-明快でシンプルなクローニングを行うために。

シンプルな 2 段階プロトコルは、反応に必要な制限酵素の数や DNA のタイプに関係なく、反応混合液を準備し、37°C で 15 分間インキュベートするだけです。

制限酵素 (RE) は、特異的な 4～8 塩基対の反転反復認識配列の部位で二本鎖 DNA を切断することで機能します。 DNA 開裂の産物は平滑端末であるか、または 5′ あるいは 3′ オーバーハングであるかのいずれかです。

制限消化によって生成した末端のタイプに関わらず、DNA の開裂は、末端に 3′ 水酸基および 5′ リン酸基を持つフラグメントを作成します。 DNA リガーゼは ATP 依存した反応において二重鎖 DNA (あるいは RNA) の 5′ リン酸基と 3′ 水酸基を共有結合的に結合します。

アルカリホスファターゼは DNA や RNA から 3′ および 5′ リン酸を加水分解します。これは、末端を標識する前に 5′ リン酸基を除去したり、挿入ライゲーションの前にベクターを脱リン酸化する時に適しています。これはまたタンパク質の脱リン酸化にも使用できます。

末端修復は、5′ または 3′ のオーバーハングを伴う DNA が 5′リン酸化平滑端末 DNA に転換され、平滑端末クローニングベクターへの効率的なライゲーションを可能にします。

ポリメラーゼは平滑端末の作成や標識 DNA の取り込むために使用されます。

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