撮り直し不要!ウェスタンブロットの撮影はますます簡単に。

Invitrogen iBright Imaging Systemなら、効率的で簡便なウェスタンブロットおよびゲルからの画像取得とデータ解析が可能です。こちらの製品は、あらゆる経験レベルの研究者にとって使いやすい先進の自動機能およびインターフェースを備えており、ハイレベルなウェスタンブロッティングを行えます。iBright Imaging Systemはお客様の研究を強力にサポートする化学発光・蛍光撮影装置です。

“iBright Imagerは、信じられないほどユーザーフレンドリーですね!”

– Rebecca Sinnott DeVaux, SUNY

以下のタブを開いて、iBright Imaging Systemによるウェスタンブロットおよびゲルイメージングの詳細についてご覧ください。

簡単操作—操作は当社のLCD静電式タッチスクリーンを使用するところから始まります。他の一般的なタッチスクリーンデバイスの要領でワンタッチで操作が可能です。

Figure 1. Touch screen controls.

サンプルをロードするだけ—電動引き出しを使用してサンプルを挿入します。iBright Imaging Systemのインターフェースは、シンプルで論理的に設計されているため最小限のトレーニングで簡単に使用することができます。ワークフローはイメージングモード間で類似しているため、サンプルタイプに関わらず、スムーズにイメージング操作を行えます。 

手間のかからないサンプルのアラインメント、フォーカス、およびズーム設定—iBright Imaging Systemは、サンプルドアを開き、サンプルを何度も置きなおして、調整する必要なく、サンプル位置を自動的に決定し、サンプルステージを左右に最大10度機械的に回転させることができます。デジタル回転はデータ改ざんにつながる可能性があるため、機械的な回転はデジタル回転よりも望ましいとされます。 

視野を最大化するためにサンプルのズームが必要な場合は、iBright Imaging Systemが自動でこれを行います。1つのブロットを撮影する場合、カメラはサンプル方向に移動します(最大2xズーム)。これにより、カメラはサンプルに物理的に接近し、感度が最大化され、光がカメラセンサーに届く距離が短縮されます。iBright Imaging System では、各ズームレベルで自動的にフォーカスが調整され、クリアな画像を取得することができます。 

Figure 3. Sample rotation. Graphic depicting iBright Imaging System stage before and after rotation.
Fig. 4. Digital vs mechanical sample rotation. Left: digital rotation (10°)—pixels rotate with digital rotation, so bands appear jagged. Right: Mechanical rotation (10°)—sample rotates so bands remain smooth as pixels remain aligned
Figure 5. Zoom function. At 1x zoom, the field of view is 22.5 cm (W) x 18.0 cm (H). Four full-sized mini blots or gels can be accommodated (left panel). The same blot outlined in the left panel, when repositioned in the center of the field of view, at 2x zoom (right panel).

解析に要する時間が大幅に短縮—iBright Imaging Systemには、自動オンボードデータ解析機能が備わっており、即座にレーンおよびバンドを同定し、分子量マーカーをオーバーレイ表示することが可能なため、イメージング後の基本的なデータ解析が大幅に簡略化および効率化されます。定量および濃度決定は、この装置上で直接行うことができます。最大4つのブロットまたはゲルを同時に解析可能なため、スループットを大幅に向上させることができます。

Figure 6. Automatic lane and band identification of four mini blots in chemiluminescent blot acquisition mode.

クリアなな画像の取得—Smart Exposure技術によって、素早く最適な露光時間が決定し、画像の露光が過剰または不足となる可能性、および所望のシグナルが得られるまで露光を繰り返す必要性を最小限に抑えます。Smart Exposure技術を高感度の9.1メガピクセル(MP)冷却CCDカメラに組み合わせることで、iBright装置は強力なイメージングの潜在能力を発揮し、タンパク質発現における微妙な差異の検出を可能とします。

Figure 7. Detect subtle protein modifications using iBright Imaging Systems. HeLa cells were stimulated with IFN-alpha to induce protein phosphorylation, or with staurosporine to induce protein cleavage. Following stimulation, cells were lysed with IP Lysis Buffer (Cat. No. 87787). Equal amounts (20 µg) of the cell lysates were loaded onto 4–20% Tris-glycine gels (Cat. No. WT4202BOX). Proteins were transferred to nitrocellulose membranes (Cat. No. 88018) using the Thermo Scientific Pierce Power Blotter (Cat. No. 22834), and the membranes were then blocked with 5% milk in TBS-Tween 20 (TBST, Cat. No. 28360) for at least 30 min. The membranes were probed overnight at 4°C with antibodies against PARP (Cat. No. MA5-15031, 1:1,000 dilution) (left panel), or phospho-STAT3 (Cat. No. MA5-15193, 1:500 dilution) and STAT3 (Cat. No. MA1-13042, 1:5,000 dilution) (right panel). Blots were washed 3 times for at least 10 min each in TBST, and probed with HRP-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody (Cat. No. 31460, 20 ng/mL) (left panel) or HRP-conjugated goat anti-mouse secondary antibody (Cat. No. 31430, 20 ng/mL) (right panel) for 1 hr at room temperature. Blots were again washed 3 times for at least 10 min each in TBST, and developed using SuperSignal West Dura substrate (Cat. No. 34076). Bands were visualized on the iBright FL1000 Imaging System with 2 min exposure (PARP), 3 min exposure (phospho-STAT3) and 52 sec exposure (STAT3).

Figure 8. iBright Imaging Systems feature a powerful 9.1 MP camera for greater sensitivity compared to instruments with a lower-resolution camera. Two-fold serial dilutions of HeLa cell lysate (starting at 80 µg/lane) were loaded onto 4–20% Tris-glycine gels (Cat. No. WT4202BOX). Proteins were transferred to nitrocellulose membranes (Cat. No. 88018) using the Pierce Power Blotter (Cat. No. 22834), and the membranes were then blocked with 5% milk in TBS-Tween 20 (TBST, Cat. No. 28360) for at least 30 min. The membranes were probed overnight at 4°C with antibodies against Ku80 (Cat. No. MA5-14953, 1:1,000 dilution) or DDX3 (Cat. No. PA5-17165, 1:1,000 dilution). Blots were washed 3 times for at least 10 min each in TBST, and probed with an HRP-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody (Cat. No. 31460, 10 ng/mL (Ku80 blot) and 40 ng/mL (DDX3 blot)) for 1 hr at room temperature. Blots were again washed 3 times for at least 10 min each in TBST, and developed using SuperSignal West Pico PLUS substrate (Cat. No. 34580). Bands were visualized on the iBright FL1000 Imaging System (top blots), another imaging device with a lower-quality CCD camera (bottom blots), each with 10 sec exposures.

Figure 9. Comparison of detection sensitivity and dynamic range for film and the iBright FL1000 Imaging System. A luminometer reference plate emitting light at varying fixed intensities and specific wavelength (540nm) was used to expose film or to acquire an image on the iBright FL1000 Imaging System for 10 sec (left panel). More luminometer spots are visible on the image from the iBright instrument, indicating higher sensitivity compared to film. iBright and film 1 min exposures to the same luminometer plate (middle panel) with graphical analysis. Analysis reveals the better signal linearity and dynamic range of signals acquired using the iBright FL1000 Imaging System compared to film (right panel).

小さい設置面積で広視野—iBright Imaging Systemは、<227/>比較的狭い装置設置面積で機能的な光視野を実現するように設計されています。

Figure 10. The large field of view (22.5 x 18.0 cm) enables capture of up to 4 mini blots or gels. Left: four mini blots. Right: signals captured in fluorescent blot mode.

長寿命のepi-LEDイルミネーター—iBright FL1000 Imaging Systemは、蛍光イメージングアプリケーション用に2種類の高品質かつ長寿命のepi-LEDを使用しています。1つは広域スペクトルの白色LEDをRGB蛍光および遠赤外蛍光用の光源として使用しています。もう1つのLEDは近赤外蛍光用に最適化されています。これらの光源からの光は、励起フィルターと蛍光フィルターを透過し、タンパク質ゲル、核酸ゲル、およびブロットイメージングアプリケーションに使用される多くの試薬オプションの検出を可能とします (表1)。

表 1.ゲルおよびブロットから取得可能な画像データのタイプの概要

イメージング可能なゲル・ブロット 画像化されるシグナルの種類
タンパク質ゲル ゲルの比色染色(例:Coomassie色素、銀)およびメンブレン(例:Ponceau S、Thermo Scientific MemCode染色)
核酸ゲル エチジウムブロマイドおよびInvitrogen SYBR色素染色
化学発光ブロット 全ての一般的なHRP基質およびAP基質(例:Thermo Scientific SuperSignal substratesおよびInvitrogen WesternBreeze substrates)を用いる化学発光
蛍光ブロット* 一般的なRGB(可視領域)および近赤外フルオロフォア(例:Invitrogen Alexa Fluor、Alexa Fluor Plus色素、Thermo Scientific DyLight色素)を用いる蛍光発光
*FL1000モデルのみ

研究を加速化—iBright FL1000モデルは5つの蛍光チャンネルを備え、最大4色の蛍光ウェスタンブロットマルチプレックス解析を可能とし、同じブロット上にある複数のタンパク質の解析の可能性を拡大します。実験を向上させる、意味のある代表的な比較結果を得ました。Smart Exposure技術を用いると、各蛍光チャンネルごとにシグナル/ノイズ比が最適化されるため、マルチプレックス蛍光ウェスタンブロットデータの取得がさらに改善されます。

Figure 11. Two-channel (near-IR) imaging of a fluorescent western blot. Several HA-tagged proteins were expressed in HeLa cell extract using the Thermo Scientific 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit (Cat. No. 88890) and appropriate expression-ready clones. The resulting reaction mixtures were prepared for SDS-PAGE and electrophoresed: Erythropoietin precursor, lanes 1-2; Streptokinase, lanes 3-4; Caveolin-1, lanes 5-6; molecular weight marker, lane 7; Argonaute-2, lanes 8-9; Regulatory-associated protein of mTOR, lanes 10-11; Bcl2-associated agonist of cell death, lanes 12-13; Retinoblastoma susceptibility protein, lanes 14-15. The proteins were transferred to a PVDF membrane using the Pierce Power Blotter (Cat. No. 22834), and the membrane was blocked and probed with the following primary antibodies: mouse anti-HA (Cat. No. 26183) and rabbit anti–cyclophilin B (Cat. No. PA1-027A). Cyclophilin-B is present in the HeLa cell extract and serves as a control in this experiment. The membrane was washed and probed with the following secondary antibodies in TBS-Tween 20: goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 800 (Cat. No. A32735) (pseudocolored in red) and goat anti-mouse Alexa Fluor Plus 680 (Cat. No. A32729) (pseudocolored in green). The membrane was washed and imaged on the iBright FL1000 Imaging System.
Figure 12. Four-channel imaging of a fluorescent western blot. Up to four different proteins can be imaged simultaneously on the same blot. HA-tagged RB-1 was expressed in HeLa cell extract using the 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit (Cat. No. 88890) and appropriate expression-ready clones. The resulting reaction mixture was prepared for reducing SDS-PAGE, serially diluted, and electrophoresed on a Novex WedgeWell 4–20% Tris-glycine gel (Cat. No. XP04200PK2). The protein was transferred to a PVDF membrane using the Pierce Power Blotter (Cat. No. 22834), and the membrane was blocked and probed with the following primary antibodies: chicken anti-calreticulin (Cat. No. PA1-903), rabbit anti-HSP90 (Cat. No. PA3-013), and mouse anti-p23 (Cat. No. MA3-414). The membrane was washed and probed with the following secondary antibodies in TBS-Tween 20: goat anti-chicken Alexa Fluor 546 (Cat. No. A11040) (pseudocolored in yellow), goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 800 (Cat. No. A32735) (pseudocolored in green), and goat anti-mouse Alexa Fluor Plus 680 (Cat. No. A32729) (pseudocolored in red). The membrane was again washed and probed for 1 hr with mouse anti-HA primary antibody directly conjugated to Alexa Fluor 488 (Cat. No. 26183-D488) (pseudocolored in blue), in TBS-Tween 20. The membrane was washed and imaged on the iBright FL1000 Imaging System.

iBright Imaging Systemは、緑色LEDをベースとするトランスイルミネーターを利用しています。これにより、エチジウムブロマイドやSYBR Green色素などの一般的なDNA色素を効率的に励起し、多くの付加的な利点を提供することができます。

有害な紫外線不使用: 白色UV光は多くの蛍光色素および染色を効率的に励起しますが、UV光の使用は健康被害が懸念されます。また、長時間のUV光への曝露はDNAサンプルを損傷する可能性があり、サブクローニングなどの下流アプリケーションでの使用においてサンプルの完全性を妥協することとなります。

水銀廃棄物の発生なし:UVトランスイルミネーターバルブには、有害物質である水銀が含まれます。そのため、取り扱いおよび廃棄に特別な配慮が必要とされます。

バルブ寿命が向上:LEDバルブはUVバルブよりも実質的に長い実時間寿命を持つため、装置の寿命が延長され大幅にコスト削減することができます。

シンプルなパッケージで高性能iBright Analysis Softwareは、iBright Imaging Systemのオンボード解析機能に基づいて、綿密な画像調整およびデータ解析の能力を発揮します。iBright Analysis Softwareは、全て直感的な操作で画像取得を完了できるように設計されています。

Figure 13. iBright Analysis Software features extensive analysis and image adjustment functions.

クラウド接続が生産性を向上—iBright Analysis Softwareは、Thermo Fisher Cloudウェブベースのプラットフォームに組込まれており、Thermo Fisher Connectの一部です。データは、iBright Imaging Systemから直接エクスポートし、Thermo Fisher Cloudに安全に保管することができます。iBright Analysis Softwareはウェブベースのため、インターネット接続可能な環境である限り、データへのアクセス、レビュー、解析、および共有が可能です。また、Thermo Fisher Connectでは、 装置のステータス、ファームウェア エディション、および利用履歴を決定することができ、遠隔モニタリングの活用によるさらにハイレベルな管理が可能です。

お客様のデータを安全に保管—Thermo Fisher Connect は、ハイレベルなデータ暗号化およびネットワークファイアウォールを含む強力なセキュリティスタンダードを採用したThermo Fisher Cloudによって性能が拡張されるため、お客様のデータは安全に保持されます。Thermo Fisher Cloudは、データのバックアップと復旧も提供しているため、災害時であってもお客様のデータは安全に保持されます。 

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