Die Partitionierung ist die Grundlage für die digitale PCR
 

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Bei ihrer Einführung im Jahr 1988 wurde eine 384-Well-Platte verwendet, um die Prinzipien der „Grenzverdünnung“ für den Nachweis seltener Ziele zu demonstrieren (1). Da sich DNA-Amplifikation und DNA-Quantifizierung mittels digitaler PCR (dPCR) weiterentwickelt hat, haben sich auch Methoden der Reagenzaufteilung oder -partitionierung weiterentwickelt. Eines der gängigsten Verfahren, die heute zur Verfügung stehen, ist die Anwendung mikrofluidischer Technologie, um viele kleine, isolierte Reaktionen über Emulgierung in Tröpfchen zu erzeugen. Dadurch können Zehntausende von nun deutlich kleineren Tropfen pro dPCR-Reaktion erzeugt werden. Durch die Erhöhung der Tröpfchenanzahl wird die Fähigkeit verbessert, seltene Ziele zu erkennen, und die Genauigkeit für Ziele mit höherer Konzentration erhöht, was essenziell den dynamischen Bereich wesentlich erweitert (2, 3).


Präzise und genaue digitale PCR
 

Das Applied Biosystems QuantStudio Absolute Q Digital-PCR-System basiert auf seiner firmeneigenen Mikrofluidik-Array-Platten-Technologie (MAP), um hochgenaue dPCR-Ergebnisse zu liefern. Funktionsweise:

Die MAP (Abbildung 1) verfügt über 16 dPCR-Reaktionseinheiten, die leicht als undurchsichtige Quadrate unterschieden werden können. Beim Vergrößern besteht jede dPCR-Reaktionseinheit (undurchsichtiges Quadrat) aus 20.480 fixierten Array-Mikrokammern. Die Mikrokammern selbst sind über ein Verteilnetzwerk verbunden, das zur Lieferung von PCR-Reagenzien verwendet wird. Sobald die Reagenzien in die Mikrokammern aufgeteilt wurden, wird die PCR-Amplifikation fortgesetzt, und die Anzahl der Mikrokammern mit erfolgreicher DNA-Amplifikation wird gezählt.

Microfluidic array plate graphic
Abbildung 1. Mikrofluidik-Array-Platten-Technologie


Größere Konsistenz als andere dPCR-Methoden
 

Einigen emulsionsbasierten oder Tröpfchen-Digital-PCR-Technologien (droplet digital PCR, ddPCR) mangelt es aufgrund der Abhängigkeit von einem an sich stochastischen Prozess, der Scherung von Flüssigkeiten, um einzelne Partitionen zu erstellen, an Konsistenz. Dies kann dazu führen, dass die Gesamtzahl der pro dPCR-Reaktion generierten Partitionen sehr variabel ist.

Die QuantStudio Absolute Q MAP-Technologie hingegen basiert nicht auf der in Tröpfchen verwendeten Flüssigkeitsscherung oder auf einer physischen Verlagerung von überschüssigen Reagenzien, um Partitionen oder Mikropartitionen zu bilden. Die MAP-Technologie bietet nicht nur eine überragende Konsistenz, weniger Reagenzausschuss und einen vereinfachten Arbeitsablauf, sondern bietet insgesamt eine höhere Volumengenauigkeit, eine höhere Anzahl von erzeugten Mikrokammern und eine genauere Quantifizierung.


Ein Blick auf die Daten:
 

Um die Art der Daten zu demonstrieren, die von der MAP16-Platte auf dem QuantStudio Absolute Q System erzeugt werden, haben wir einen Multiplex-Assay verwendet, der alle vier optischen Kanäle des QuantStudio Absolute Q Systems verwendet, um Ziel 1 (FAM), Ziel 2 (VIC), Ziel 3 (ABY) und Ziel 4 (CY5) zu detektieren. In Abbildung 2 sind die daraus resultierenden dPCR-Fluoreszenzdiagramme und die Abbilder der Mikrokammerpositivität, die von der QuantStudio Absolute Q Analyse Software aus einer einzigen Reaktion auf der MAP16-Platte erzeugt wurden, dargestellt.

Data MAP 16 plate
Abbildung 2. Map16-Platte mit Multiplex-Durchlauf über 4 Kanäle.


Erzeugen von 20.000 dPCR-Mikroreaktionen – jedes Mal
 

Um die außergewöhnliche Konsistenz der Mikrokammer-Befüllung herauszustellen, haben wir eine Studie durchgeführt, um die Wiederholbarkeit der hoch akzeptierten Mikrokammer-Zählungen über die MAP für verschiedene Assays zu demonstrieren (Abbildung 3). Für diese Studie wurden 14 Platten mit firmeneigenen Standard-QK-Assays ausgeführt. Im dPCR-Arbeitsablauf, nachdem die dPCR beendet ist, findet und inspiziert die QuantStudio Absolute Q Analyse-Software jede Mikrokammer innerhalb einer dPCR-Reaktion oder eines dPCR-Arrays mithilfe eines QK-Kanals. Nur die Mikrokammern, die eine einheitliche Befüllung und keine offensichtlichen Anzeichen von Verunreinigungen nicht PCR-bezogener Autofluoreszenz aufweisen, werden akzeptiert. Bei den 14 in der Studie enthaltenen Platten haben wir eine durchschnittliche Akzeptanz von 99,7 % (±0,6 %) der Mikrokammern festgestellt. Wir haben die Gesamtzahl der akzeptierten Mikrokammern pro Array für jede der 14 MAPs graphisch dargestellt, um die Gesamtkonsistenz für alle Platten zu zeigen. Die gestrichelte Linie bei 20.480 zeigt die Gesamtzahl der auf der MAP verfügbaren Mikrokammern an. Bei allen Arrays wurden durchschnittlich 20.417 (±133) Mikrokammern pro Platte akzeptiert.

Warum ist die Anzahl der analysierten Mikrokammern von Bedeutung?

Weil Statistik die Grundlage der dPCR-Analyse bildet.

Bei der Poisson-Modellierung (oben) werden sowohl die Gesamtzahl der analysierten Mikrokammern als auch das Volumen der Mikrokammer zur Berechnung der Endkonzentrationen aus dPCR-Reaktionen verwendet. Daher ist es wichtig, dass beide Variablen sehr konsistent sind und präzise berechnet werden. Die MAP-Technologie verbessert die Konsistenz der Gesamtzahl akzeptabler Mikrokammern, die Präzision der Volumen und damit insgesamt die Quantifizierung.


Zusätzliche Ressourcen
 


Literatur
 

  1. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988;239(4839):487‐491.
  2. Huggett JF, Foy CA, Benes V, et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin Chem. 2013;59(6):892‐902.
  3. Quan PL, Sauzade M, Brouzes E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 2018;18(4):1271.


For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

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