Sistema de RT-PCR SuperScript™ III de un paso con ADN polimerasa Platinum™ Taq
Sistema de RT-PCR SuperScript&trade; III de un paso con ADN polimerasa Platinum&trade; <i>Taq</i>
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Sistema de RT-PCR SuperScript™ III de un paso con ADN polimerasa Platinum™ Taq

El sistema de RT-PCR SuperScript™ III One-Step con ADN polimerasa Platinum™ Taq se ha diseñado para ofrecer una detección yMás información
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El sistema de RT-PCR SuperScript™ III One-Step con ADN polimerasa Platinum™ Taq se ha diseñado para ofrecer una detección y análisis de punto final sensible y reproducible de moléculas de ARN mediante transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Con esta práctica formulación de un solo paso, puede realizar tanto la síntesis de ADNc como la amplificación por PCR en un único tubo utilizando cebadores específicos de genes y detectar objetivos de ARN de ARN total o ARNm. El sistema utiliza una mezcla de transcriptasa inversa SuperScript™ III y ADN polimerasa Platinum™ Taq en un tampón de reacción optimizado, y puede detectar una gran variedad de objetivos de ARN, desde 200 bp hasta 4,5 kb. La cantidad de material de partida puede oscilar entre 0,01 pg y 1 µg de ARN total. Ventajas clave de este kit:

Sensible: detección rutinaria hasta en 0,01 pg de ARN total (consulte la figura)
Comodidad: formato de un paso que ofrece rapidez, comodidad y menor variabilidad de reacción a reacción
Especificidad: use RT SuperScript™ III para la síntesis de ADNc hasta 55 °C, para un cebado más específico con cebadores específicos de genes (consulte figura)
Tamaño Amplicon: detección compatible de objetivos de hasta 4,5 kb de longitud para una mayor flexibilidad

Transcriptasa inversa SuperScript™ III La transcriptasa inversa
SuperScript™ III es una versión de M-MLV RT que se ha diseñado para reducir la actividad de ARNasa H y proporcionar una mayor estabilidad térmica. La enzima puede sintetizar ADNc en un intervalo de temperatura de 45–60 °C, proporcionando una mayor especificidad, mayor producción de ADNc y más cantidad de producto de cadena completa que otras transcriptasas inversas. Como la RT SuperScript™ III no se ve significativamente inhibida por el ARN de transferencia y ribosomal, se puede emplear para sintetizar ADNc a partir de ARN total. ADN polimerasa

Platinum™ Taq La ADN polimerasa
Platinum™ Taq es una ADN polimerasa Taq recombinante compleja con un anticuerpo patentado que bloquea la actividad de la polimerasa a temperaturas ambiente. La actividad se restaura después del paso de desnaturalización del ciclo de PCR a 94 °C, proporcionando un sistema automático de inicio en caliente en la PCR para mayor sensibilidad, especificidad y rendimiento.

Para uso exclusivo en investigación. No apto para uso en procedimientos diagnósticos.

Especificaciones
Tipo de producto finalPCR amplificada, ADNc
FormatoKit
Inicio en calienteInicio en caliente integrado
N.º de reacciones100 reacciones
Temperatura óptima de reacción50 °C
PolimerasaADN polimerasa Taq Platinum
Cantidad100 reacciones
Formato de reacciónComponentes premezclados
Tipo de reactivoTranscripción reversa
Transcriptasa inversaSuperScript III
Actividad de la ribonucleasa HReducido
Condiciones de envíoHielo seco
Tamaño (producto final)Hasta 4,5 kb
Material de partidaARN
TécnicaRT-PCR de 1 pasos
Método de detecciónSonda de cebado
GC-Rich PCR PerformanceAlto
Método de PCRRT-qPCR de 1 paso
Velocidad de reacción30 min
Unit SizeEach
Contenido y almacenamiento

• Mezcla Superscript III RT/Platinum Taq (200 μl)
• Mezcla de reacción2X (3 x 1 ml)
• 5 mM de sulfato de magnesio (500 μl)

Almacenar los componentes entre –30 °C y –10 °C.

Preguntas frecuentes

How can I remove genomic DNA contamination from my sample prior to performing RT-PCR?

We recommend using ezDNase (Cat. No. 11766051). ezDNase Enzyme's high specificity for double-stranded DNA enables efficient and fast genomic DNA removal without reduction in the quality or quantity of RNA. ezDNase Enzyme is heat-labile and so can be easily deactivated by heat treatment at moderate temperature (55 degrees C). These features make ezDNase Enzyme an excellent choice for genomic DNA removal prior to reverse transcription reactions.

How much RNA should be employed for first-strand cDNA synthesis?

The amount of RNA template for a cDNA synthesis is highly flexible and depends upon the amount of sample available and an individual's need. In general, 1 µg total RNA is used in a typical 20-µL RT reaction.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within ourReverse Transcription and RACE Support Center.

Should I treat the cDNA with RNase H prior to downstream processing?

RNase H treatment is not always necessary. Many PCR reactions work without it. However, for cDNA synthesized with RNase H-deficient reverse transcriptases (like SuperScript II, III, and IV), RNA/cDNA hybrids—especially GC-rich ones—may not denature well, reducing PCR sensitivity. RNase H treatment can help in such cases. Additionally, RNase H treatment is beneficial for cloning larger fragments.

What percentage of RNA is converted to cDNA when performing reverse transcription?

This depends highly on the quality of the sample. mRNA itself makes up 1-5% of total RNA. Depending on the primer and enzyme used, reverse transcription can covert >70% of that into cDNA.

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I'm setting up my RT reaction and am trying to decide whether I should use random primers, oligo(dT) primer, gene-specific primer, or oligo(dT)/random mix primers. What would you suggest?

Random primers are the best choice for degraded RNA, RNA with heavy secondary structure, non-polyadenylated RNA, or prokaryotic RNA. It is recommended only for two-step RT-PCR, and typically gives the highest yields, although the cDNA may not necessarily be full length. Oligo(dT) primers are good to use when trying to recover full-length cDNA from 2-step RT-PCR. The reaction is influenced by secondary structure and RNA quality. Gene specific primers should be used for very specific, mainly one-step RT-PCR reactions.

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Citations & References (2)

Citations & References
Abstract
Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B.
Authors:Tang YW, Lowery KS, Valsamakis A, Schaefer VC, Chappell JD, White-Abell J, Quinn CD, Li H, Washington CA, Cromwell J, Giamanco CM, Forman M, Holden J, Rothman RE, Parker ML, Ortenberg EV, Zhang L, Lin YL, Gaydos CA,
Journal:J Clin Microbiol
PubMed ID:23077123
Respiratory tract infections caused by influenza A and B viruses often present nonspecifically, and a rapid, high-throughput laboratory technique that can identify influenza viruses is clinically and epidemiologically desirable. The PLEX-ID Flu assay (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) incorporates multilocus PCR and electrospray ionization-mass spectrometry to detect and differentiate ... More
Two isoforms of Npap60 (Nup50) differentially regulate nuclear protein import.
Authors:Ogawa Y, Miyamoto Y, Asally M, Oka M, Yasuda Y, Yoneda Y,
Journal:Mol Biol Cell
PubMed ID:20016008
Npap60 (Nup50) is a nucleoporin that binds directly to importin alpha. In humans, there are two Npap60 isoforms: the long (Npap60L) and short (Npap60S) forms. In this study, we provide both in vitro and in vivo evidence that Npap60L and Npap60S function differently in nuclear protein import. In vitro binding ... More