LightShift™ Chemiluminescent RNA EMSA Kit

El kit de EMSA de ARN quimioluminiscente Thermo Scientific LightShift ofrece una solución no radioactiva para el estudio de las interacciones ARN-proteína mediante un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA).

Características del kit de EMSA de ARN quimioluminiscente LightShift:

• Sensible: detección quimioluminiscente comparable a la detección radiactiva
• Ahorro de tiempo: revele películas de rayos X en 1 a 5 minutos de exposición, frente a la exposición de 16 horas que requieren los sistemas radioactivos
• Flexible: compatible con sondas de ARN biotiniladas con métodos diferentes
• Fácil de usar: el kit completo incluye reactivos optimizados para reacciones de unión y detección de sondas de ARN
• No radioactivo: elimina la preocupación por los desechos de ARN radioactivos

El kit de EMSA de ARN utiliza sondas de ARN biotiniladas y un sistema de sustrato quimioluminiscente para lograr una detección rápida y segura de complejos ARN-proteínas con una sensibilidad equivalente a los métodos isotópicos tradicionales de ³²P. El kit completo incluye todos los reactivos necesarios para configurar y optimizar las condiciones de unión proteína-ARN, un control positivo para las interacciones proteína-ARN y reactivos para la detección quimioluminiscente de la interacción del ácido nucleico.

Acerca del kit de EMSA de ARN quimioluminiscente LightShift
El kit de EMSA de ARN quimioluminiscente LightShift es una técnica in vitro para la detección de interacciones proteína-ARN a través de cambios en los patrones de migración por electroforesis en gel similares al popular ensayo de cambio de gel de ADN. En una EMSA de ARN, una sonda de ARN etiquetada se incuba con una muestra de proteína para iniciar la unión. Una vez formado un complejo, la muestra se separa mediante electroforesis de gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Debido a que los complejos ARN-proteínas migran más lentamente que las sondas de ARN libre, la diferencia resultante en la distancia de migración se puede visualizar con el ensayo de cambio de gel de ARN. La especificidad de las interacciones ARN-proteína se valida a través de la competitividad de unión con el exceso de ARN no etiquetado que disminuye la señal de las interacciones específicas. Por lo general, no se espera que las sondas de ARN mutadas o irrelevantes compitan por interacciones específicas y no deben reducir la intensidad de los cambios de banda específicos cuando se detectan en la EMSA. El kit completo de EMSA de ARN quimioluminescente LightShift incluye todos los reactivos necesarios para configurar y optimizar un ensayo de cambio de gel de ARN, incluido un control positivo para la formación de complejos ARN-proteínas.

El kit de EMSA de ARN quimioluminiscente LightShift utiliza sondas de ARN biotiniladas, estreptavidina-HRP y detección quimioluminiscente para proporcionar una sensibilidad similar a la del uso de sondas de ARN radiactivo, pero con una detección más rápida. Las sondas de ARN etiquetadas pueden adquirirse comercialmente o generarse mediante reacciones de transcripción in vitro con nucleótidos biotinilados o mediante ligadura enzimática de etiquetas de biotina al extremo 3' de una cadena de ARN mediante el kit de biotinilación del extremo 3’ de ARN Thermo Scientific Pierce. El kit de EMSA de ARN quimioluminiscente LightShift es eficaz para sondas de ARN biotiniladas por cualquiera de estos tres métodos; sin embargo, la estructura secundaria del ARN puede verse afectada por la incorporación interna de nucleótidos biotinilados durante la síntesis de la sonda de transcripción de ARN in vitro. Por lo tanto, para ciertas interacciones, las sondas de ARN sintetizadas a medida o las sondas biotiniladas de extremo 3' pueden resultar necesarias para que se produzcan las interacciones proteína-ARN adecuadas.

Acerca del kit de control positivo de EMSA de RNA quimioluminiscente LightShift
El control positivo incluido en el kit de EMSA de RNA quimioluminiscente LightShift es la sonda de ARN del elemento sensible al hierro (IRE). Las reacciones de unión del IRE se configuran y detectan en paralelo con las demás muestras experimentales. En caso de falta de hierro, la proteína sensible al hierro (IRP) permanece unida al ARN del IRE presente en la célula, lo que suprime eficazmente la traducción de ferritina (una proteína de almacenamiento de hierro) y después el receptor de hierro de transferrina. En condiciones con elevada presencia de hierro, se pierde la actividad de unión del IRE y se traduce en ferritina y transferrina. Este sistema es ubicuo y produce un cambio de banda sólido. La incubación de la reacción de control positivo con ARN de IRE sin etiquetar 200 veces en exceso molar reducirá la señal de cambio de banda del IRE específica en aproximadamente un 70 %; mientras que un exceso similar de una sonda de ARN no relacionada no reducirá significativamente el cambio de banda del IRE. Estos controles se pueden utilizar en cada experimento de cambio de gel de ARN para validar la configuración, la electroforesis, la transferencia y la detección adecuadas de la formación del complejo proteína-ARN.

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