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T4 DNA-Ligasepuffer
Invitrogen™

T4 DNA-Ligasepuffer

T4 DNA-Ligase katalysiert die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen doppelsträngigen DNAs mit 3´-Hydroxyl- und 5´-Phosphat-Enden unter Verwendung von ATP. Der spezielleWeitere Informationen
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KatalognummerMenge
463000182 × 1 ml
Katalognummer 46300018
Preis (EUR)
57,65
Exklusiv online
62,00
Ersparnis 4,35 (7%)
Each
Menge:
2 × 1 ml
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Preis (EUR)
57,65
Exklusiv online
62,00
Ersparnis 4,35 (7%)
Each
T4 DNA-Ligase katalysiert die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen doppelsträngigen DNAs mit 3´-Hydroxyl- und 5´-Phosphat-Enden unter Verwendung von ATP. Der spezielle T4 DNA-Ligasepuffer optimiert die Ligation, die in 5 Minuten durchgeführt werden kann (1). Einzelsträngige Nukleinsäuren stellen keine Substrate für dieses Enzym dar. Ein technisches Bulletin zu T4-DNA-Polymerase ist verfügbar.

Anwendungen: Klonierung (Ligation stumpfer oder kohäsiver Enden) (2). Hinzufügen von Linkern oder Adaptern zu Blunt-End-DNA (2).

Quelle: Aus E. coli œ-Lysogen NM989 aufgereinigt.

Leistungs- und Qualitätskontrolle: Endodeoxyribonuklease-, 3´- und 5‘´-Exodeoxyribonuklease-Assays; geprüfte Ligationseffizienz

Einheiten-Definition: Eine Einheit katalysiert den Einbau 1 nmol 32P-markiertem Pyrophosphat in ATP in 20 Min. bei 37°C. (Eine Einheit entspricht ca. 300 Ligationseinheiten mit kohäsiven Enden.)

Reaktionsbedingungen pro Einheit: 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 66 µM ATP, 3,3 µM 32P-markiertes Pyrophosphat und Enzym in 0,1 ml 20 Min. lang bei 37°C.
Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung bei diagnostischen Verfahren.
Specifications
Kompatibler Puffer5X Reaktionspuffer
ProdukttypT4-DNA-Ligasepuffer
Menge2 × 1 ml
VersandbedingungZugelassen für den Versand auf Nass- oder Trockeneis
Unit SizeEach
Inhalt und Lagerung
T4 DNA Ligase wird mit einem Fläschchen mit 5x Reaktionspuffer [250 mM Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM MgCl2, 5 mM ATP, 5 mM DTT, 25 % (w/v) Polyethylenglycol-8.000] geliefert. Bei -20°C lagern.

Häufig gestellte Fragen (FAQ)

What are common inhibitors of the T4 DNA ligase?

dATP is a competitive inhibitor. Phosphate will reduce ligation efficiency. Detergents in your ligation buffer will likely not affect activity. High levels (0.2M) Na2+, K+, Cs+, Li+, and NH4+ inhibit the enzyme almost completely. Polyamines, spermine, and spermidine also serve as inhibitors.

Do both my insert and vector have to be phosphorylated for successful ligation?

At least one molecule in a ligase reaction (i.e., insert or vector) must be phosphorylated. Ligation reactions are dependent on the presence of a 5' phosphate on the DNA molecules. The ligation of a dephosphorylated vector with an insert generated from a restriction enzyme digest (phosphorylated) is most routinely performed. Although only one strand of the DNA ligates at a junction point, the molecule can form a stable circle, providing that the insert is large enough for hybridization to maintain the molecule in a circular form.

Which T4 DNA Ligase protocol do you recommend when ligating an insert containing one cohesive (sticky) end and one blunt end?

For cloning an insert with one cohesive end and one blunt end, use the conditions for blunt ends.  The sticky end may ligate quickly, but the blunt end ligation will still be inefficient. You should use the more stringent protocol to optimize the blunt end ligation. This usually means using more enzyme (5 U), a lower reaction temperature (14C) and a longer incubation time (16-24 hours). 

Why is it necessary to dilute ligated DNA products before adding them to competent bacterial cells?

Components of the ligation reaction (enzymes, salts) can interfere with transformation, and may reduce the number of recombinant colonies or plaques. We recommend a five-fold dilution of the ligation mix, and adding not more than 1/10 of the diluted volume to the cells. For best results, the volume added should also not exceed 10% of the volume of the competent cells that you are using.

What are the recommended conditions for blunt-ended ligations?

Generally, ligations are done in a 20 µL volume. Use a total of 100 to 1000 ng of DNA with an insert to vector ratio of 3:1. Add 1.0 units (Weiss) ligase to the reaction. Incubate at room temperature for 4 h or overnight at 14-16 degrees C.

Ideally, assemble several reactions with varying ratios of vector:insert (i.e. 3:1, 5:1, 10:1, 20:1, etc.) to determine the optimal ratio for ligation.

Thermo Fisher Scientific offers T4 DNA ligase at two concentrations: 1 U/µL (Cat. No. 15224-017) and 5 U/µL (Cat. No. 15224-041). When performing blunt or TA cloning ligations, the higher concentration of ligase is generally preferred since ligating a blunt or single base overhang requires more enzyme.

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