Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells

Das Thermo Scientific™ Lysosomen-Anreicherungskit für Gewebe und kultivierte Zellen ermöglicht die Isolierung und Anreicherung intakter Lysosomen aus rohen Zell- und Gewebeextrakten. Das Kit enthält ausreichend Reagenzien für die Präparation von 25 Extrakten und verwendet OptiPrep Zelltrennungsmedien für die dichtebasierte Trennung von Lysosomen von kontaminierenden Zellstrukturen. Die isolierten Lysosomen können für eine Reihe nachgelagerter Anwendungen verwendet werden, einschließlich 2D/MS für die Proteomikforschung, Elektronenmikroskopie, Erstellen von Krankheitsprofilen und Genexpression, Signaltransduktion sowie Interaktions- oder Lokalisationsstudien.

Merkmale des Lysosomen-Anreicherungskits für Gewebe und kultivierte Zellen:

• Effizient und anwenderfreundlich –in Kombination mit Gradientenzentrifugation trennen die Reagenzien des Kits Organellen von kontaminierenden Zellstrukturen
• Kompatibel – Vorbereitung der Proben für nachfolgende Anwendungen, darunter 2D/MS, Elektronenmikroskopie, Erstellen von Krankheitsprofilen, Genexpression, Signaltransduktion und Interaktions- oder Lokalisationsanalysen
• Komplett –die Kits enthalten ausreichend Material für 25 Anwendungen

Dieses Kit ermöglicht die Anreicherung von intakten Organellen aus Zellen und Gewebe. Um Organellen von verunreinigenden anderen Zellstrukturen zu trennen, ist bei allen Kits der Einsatz von Dichtegradientenzentrifugation vorgesehen. Die isolierten Organellen können für zahlreiche nachfolgende Anwendungen eingesetzt werden, darunter 2D/MS, Elektronenmikroskopie, Erstellen von Krankheitsprofilen, Genexpression, Signaltransduktion und Interaktions- oder Lokalisationsanalysen.

Organellenanreicherung aus Gewebe:
Sechs bis acht Wochen alte weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Durchschnittsgewicht von 160 g mussten über Nacht fasten und wurden dann getötet. Leber und Nieren wurden entnommen, mit eiskaltem PBS gewaschen, mit einer chirurgischen Schere zerkleinert und anschließend mit einem Polytron™ Gewebezerreißer 45 Sekunden lang bei 8000 U/min in eiskaltem Reagenz A homogenisiert. Anschließend wurde Reagenz B hinzugefügt und das Homogenat zentrifugiert, um Zellreste zu entfernen. Der resultierende Überstand wurde auf einen diskontinuierlichen Gradienten aus OptiPrep™ Zelltrennungsmedium geschichtet und zentrifugiert, um das Zielorganell zu isolieren und anzureichern. Die Zielbande wurde aus dem Gradienten entfernt und mittels Western Blotting analysiert.

Organellenanreicherung aus Zellen:
Mehrere Zelllinien wurden auf Isolierung von Lysosomen untersucht: A431- [American Type Culture Collection (ATCC™ Ressourcenzentrum), Nr. CRL-1555], HeLa- (ATCC, Nr. CCL-2) und HepG2-Zellen (ATCC, Nr. HB-8065). Die Zellen wurden bis auf 80 bis 90 % Konfluenz kultiviert. Es wurden etwa 50 bis 200 mg feuchte Zellpaste geerntet und zur Lysosomanreicherung verarbeitet. Eisgekühltes Lysosomen-Reagenz A wurde den Zellen hinzugefügt und die Zellen wurden mit einem Misonix Sonator 3000 mit 15 Impulsen zu jeweils 15 W Leistung lysiert.

Anschließend wurde Lysosomen-Reagenz B hinzugefügt und das Homogenat zentrifugiert, um Zellreste zu entfernen. Der resultierende Überstand wurde auf mehrere diskontinuierliche Gradienten aus OptiPrep Zelltrennungsmedien geschichtet und zentrifugiert, um das Zielorganell zu isolieren und anzureichern. Die Zielbande wurde aus dem Gradienten entfernt und zusammen mit dem Gesamtlysat, auf Proteinmenge normiert (sofern nicht anders angegeben) und mittels Western Blotting analysiert.

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