Search

  • Auftragsstatus
  • Eilbestellung
  • Aktionen
Product Image
Invitrogen™

PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung

The PichiaPink™ Secretion Optimization Kit is a new recombinant protein expression system based on the yeast Pichia pastoris.
Have Questions?
KatalognummerMenge
A111501 Kit
Katalognummer A11150
Preis (EUR)
6.090,00
Each
Menge:
1 Kit
Preis (EUR)
6.090,00
Each
Das PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung ist ein neues rekombinantes Proteinexpressionssystem, das auf der Hefe Pichia pastoris basiert. Das PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung bietet Ihnen eine komfortable und kostengünstige Bioproduktion von Schüttelkolben bis zur 1.000-Liter-Produktion Ihres rekombinanten Proteins. Das PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung wird mit unseren neuen Pichia-Stämmen, den pPINK-HC- und pPINK-LC-Vektoren und Sekretsignalsequenzen für die Produktion Ihres Proteins geliefert.

• Erhalten Sie ein komplettes Kit, um mit der Proteinproduktion in Pichia pastoris zu beginnen.
• Screenen Sie Ihre Pichia-Transformanten in kürzester Zeit mittels Auxotrophie und Farbauswahl.
• Reduzieren Sie den Proteinabbau mit Protease-defizienten Pichia pastoris-Stämmen.
• Optimieren Sie die Proteinsekretion mit einer von 8 Sekretsignalsequenzen.

Das PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung enthält:
• PichiaPink™ Vektor-Kit (Kat. Nr. A11152)
• PichiaPink™ Sekretsignalset (Kat. Nr. A11155)
• PichiaPink™ Expressionsstamm-Set (Kat. Nr. A11154)
• PichiaPink™ Medien-Kit (Kat. Nr. A11156)

Eine neue Art, Pichia-Transformanten zu screenen
Das PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung verwendet Adenin-Auxotrophie zur Auswahl von Pichia-Transformanten. Die PichiaPink™ Stämme haben den ade2-Genotyp und erfordern eine Komplementierung mit dem ADE2-Gen, um ohne Adenin wachsen zu können. Auch die Verwendung eines auxotrophen Markers erleichtert die Aufrechterhaltung von Transformanten. Es sind keine Antibiotika erforderlich, um Ihre Transformanten zu erhalten.

Außerdem können Sie Pichia-Transformanten nach Farben screenen. Die nicht transformierten PichiaPink™ Stämme erscheinen als rosafarbene Kolonien, während transformierte PichiaPink™ Stämme als weiße Kolonien erscheinen (Abb. 1).

Neue Expressionsvektoren für Pichia
Das PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung wird mit dem neuen PichiaPink™ Vektor-Kit geliefert. Das Kit enthält zwei Vektoren, pPINK-LC und pPINK-HC. Die pPINK-Vektoren sind um das ADE2-Gen herum aufgebaut, um die ade2-defizienten Pichia-Stämme zu ergänzen. Beide Vektoren verwenden den Methanol-induzierten AOX1-Promotor, um Ihr Protein zu exprimieren. Der pPINK-LC integriert sich bei niedriger Kopienzahl in das Pichia-Genom, während der pPINK-HC-Vektor mit hoher Kopienzahl integriert wird.

Sowohl pPINK-LC- als auch pPINK-HC-Vektoren sind mit dem PichiaPink™ Sekretsignalset kompatibel. Mit einer 3-Wege-Ligation können Sie Ihrem Gen eine von 8 Sekretionssequenzen hinzufügen. Hinweis: Die pPINK-Vektoren exprimieren Proteine standardmäßig intrazellulär.

Sowohl das PichiaPink™ Vektor-Kit (Kat. Nr. A11152) als auch das PichiaPink™ Sekretsignalset (Kat. Nr. A11155) können separat bestellt werden, um das PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung nachzufüllen.

Halten Sie Ihre Proteine intakt
Das PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung wird mit dem PichiaPink™ Expressionsstamm-Set geliefert. Dieses Set enthält die 4 Pichia pastoris-Stämme für die Verwendung mit dem PichiaPink™ Expressionssystem. Alle 4 Stämme verfügen über den ade2-Genotyp. Außerdem enthalten 3 Stämme Knockouts in 2 Protease-Genen. Protease-defizitäre Stämme reduzieren den Bedarf an Proteasehemmern beim Zellwachstum und verbessern die Ausbeute Ihres Proteins. Testen Sie einen einzelnen Protease-Knockout oder den Doppel-Protease-Knockout, um den für Sie am besten geeigneten zu finden.

Sie können das PichiaPink™ Expression Strain Set (Kat Nr. A11154) separat bestellen, um das PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung nachzufüllen.

Medienbeutel für den Einstieg
Das PichiaPink™ Medienkit ist ein Satz praktischer vorgepackter Medienbeutel für die Verwendung mit dem PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung. Das PichiaPink™ Medien-Kit enthält Medien zum Kultivieren von PichiaPink™ Stämmen aus gefrorenen Beständen zu gebrauchsfertigen Kulturen zwecks Transformation und Auswahl. Sie können das PichiaPink™ Media Kit (Kat.- Nr. A11156) separat bestellen, um das PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung nachzufüllen.

Warum sollte man sich für das PichiaPink™ Hefe-Expressionssystem entscheiden?
Das PichiaPink™ Hefe-Expressionssystem basiert auf der Hefe Pichia pastoris. Vorteile der Pichia pastoris sind schnelles Wachstum, gut bekannter genetischer Hintergrund, einfache Medienformulierung und einfache Handhabung. Seit über 30 Jahren wird Pichia pastoris von Laboren weltweit zur Erzeugung von Hunderten verschiedener Proteine aus vielen Spezies, einschließlich der humanen (Ref. 1, 2), verwendet. Das PichiaPink™ Hefe-Expressionssystem ermöglicht eine komfortable und kostengünstige Proteinproduktion in jedem Maßstab.

Informationen zum Erwerb einer kommerziellen Nutzungslizenz für das PichiaPink™ Hefe-Expressionssysteme erhalten Sie unter outlicensing@lifetech.com.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für die therapeutische oder diagnostische Anwendung bei Tieren oder Menschen bestimmt.

Verwandte Links
• Erfahren Sie mehr über das PichiaPink™ Hefe-Expressionssystem.
• Erfahren Sie mehr über unsere anderen Proteinexpressionssysteme.

Literatur

1. Cereghino JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev. 2000 Jan;24(1):45-66. [PubMed]
2. Cereghino GP, Cereghino JL, Ilgen C, Cregg JM. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 2002 Aug;13(4):329-32. [PubMed]
Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung bei diagnostischen Verfahren.
Specifications
Bakterien- oder HefenstammPichiaPink™
ExpressionsmechanismusZellbasierte Expression
ExpressionsstabilitätStabil
ExpressionssystemHefe
Zur Verwendung mit (Anwendung)Proteinexpression
HauptbedienfelderSezernierte Expression
ProdukttypOptimierungskit
Menge1 Kit
VersandbedingungRaumtemperatur
ZelltypHefezellen
FormatKit
PromoterAOX1
SpeziesP. pastoris
VectorpPINK-LC, pPINK-HC
Unit SizeEach
Inhalt und Lagerung
Das PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung umfasst:
• Das PichiaPink™ Vektor-Kit mit einem High- und einem Low-Copy-Zahlenplasmid
• Das PichiaPink™ Sekretsignalset mit 8 Sekretsignalen
• Das PichiaPink™ Expressionsstamm-Set mit 4 Glycerin-Stämmen
• Das PichiaPink™ Medien-Kit mit 4 Basismedien

Lagern Sie Vektoren und Signalsequenzen bei -20 °Clagern
Lagern Sie die PichiaPicha™ Stämme bei -80 °Clagern
Lagern Sie das Medien-Kit bei Raumtemperatur

Häufig gestellte Fragen (FAQ)

When selecting for blasticidin-resistant transformants in the X-33 strain using pPIC6/pPIC6α vectors, why do I get large and small colonies on YPD plates containing 300 µg/ml blasticidin?

Generally, large colonies represent transformants containing pPIC6/pPIC6α integrants, while small colonies represent transformants containing pPIC6/pPIC6α non-integrants. These non-integrants have transduced the pPIC6/pPIC6α plasmid, and therefore, exhibit a low level of blasticidin resistance in the initial selection process. Upon subsequent screening, these non-integrant transformants do not retain blasticidin resistance.

When choosing a blasticidin-resistant transformant for your expression studies, we recommend that you pick blasticidin-resistant colonies from the initial transformation plate and streak them on a second YPD plate containing the appropriate concentration of blasticidin. Select transformants that remain blasticidin-resistant for further studies.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our Protein Expression Support Center.

My transformation is not working. Do you have any suggestions?

Here are some suggestinos:

- Make sure that you have harvested cells during log-phase growth (OD <1.0 generally).
- If electroporation is being used, see the electroporator manual for suggested conditions. Vary electroporation parameters if necessary.
- Use more DNA.
- Use freshly made competent cells.
- If the LiCl transformation method is being used, try boiling the carrier DNA.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our Protein Expression Support Center.

My spheroplasting of Pichia worked twice, but hasn't worked since. The OD of the culture simply does not drop.

Here are some things to consider:

- If the OD of cells that are used is too high, they will not spheroplast. Do not overgrow cells.
- Do not use old cells and make sure that they are in log phase of growth.
- Make sure to mix zymolyase well before using. Zymolyase is more of a suspension than a solution.
- Make the PEG solution fresh each time and check the pH.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our Protein Expression Support Center.

Is there a recommended protocol for fermentation using constitutive expression vectors such as pGAPZ?

Use the following high cell density protocol for pGAP clones. Feed carbon until the desired density is reached (300 to 400 g/L wet cell weight (WCW)). If the protein is well-behaved in the fermenter, increase to 300-400 g/L WCW as with methanol inducible clones. These densities can be reached in less than 48 hours of fermentation. We have fermented constitutive expressers on glycerol using these protocols with good results. Some modifications to the Fermentation Basal Salts Medium that you might want to make are:

1) Substitute 2% dextrose for the 4% glycerol in the batch medium.
2) Substitute 40% dextrose for the 50% glycerol in the fed-batch medium.
3) Feed the 40% dextrose at 12 mL/L/hr (Jim Cregg has published data on expression using several carbon sources as substrates; dextrose gave the highest levels of expression).
4) Yeast extract and peptone may be added to the medium for protein stability.

One warning: If you are working with His- strains, they remain His- after transformation with pGAPZ. Fermentation in minimal medium will require addition of histidine to the fermenter.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our Protein Expression Support Center.

Can the methanol and ammonium hydroxide solutions used to prepare Pichia fermentation medium be autoclaved?

No, you cannot autoclave methanol. There are two approaches to this, depending a bit on the size of the bioreactor and the volumes involved. You can either dilute to working concentration and filter-sterilize with a filter suitable for alcohols, or you can just assume that methanol is sterile (it should be) and dilute into sterile water. For the ammonium hydroxide solution, you should also not autoclave it. You can assume the 30% stock solution is sterile (nothing should live in this solution) and dilute into sterile water to the working concentration.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our Protein Expression Support Center.

View all PichiaPink™ Kit zur Sekretionsoptimierung FAQs