GeneArt™ Seamless Cloning and Assembly Kit

Das GeneArt™ Seamless Cloning and Assembly Kit ermöglicht die simultane und direktionale Klonierung von 1 bis 4 PCR-Fragmenten, bestehend aus einer beliebigen Sequenz, in jeden linearisierten Vektor, in einer 30-minütigen Reaktion bei Raumtemperatur. Das Kit enthält alles Notwendige für die Aneinanderreihung von DNA-Fragmenten und ihre Transformation in E. coli für die Auswahl und das Wachstum rekombinanter Vektoren.

• Schnell und einfach— Klonen von bis zu 4 DNA-Fragmenten mit der Sequenz Ihrer Wahl simultan in einem einzigen Vektor (bis 13 kb); keine Restriktionsverdauung, Ligation oder Rekombinationsstellen erforderlich
• Präzise und effizient —So konzipiert, dass beliebige Klonierungen vorgenommen werden können, und bis zu 90 % der korrekten Klone erzielt werden, ohne zusätzliche Sequenzen auszulassen
• Vektor-Flexibilität — Nutzen Sie unseren linearen Vektor oder einen Vektor Ihrer Wahl
• Kostenlose Werkzeuge — Erstellen Sie DNA-Oligos usw. mit Hilfe unserer kostenlosen webbasierten Schnittstelle, die Sie schrittweise durch das Projekt führt
• Diverse Anwendungen — Optimieren Sie synthetische und molekulare Biologietechniken durch rasche Kombination, Addition, Löschung oder Austausch von DNA-Segmenten

Für das Klonen von mehr als 4 DNA-Fragmenten, endgültigen Molekülen größer als 110 kb oder für die Verwendung von bereits vorhandenen DNA-Elementen, die für eine Amplifikation über PCR zu lang sind, eignet sich möglicherweise dasGeneArt™ High-Order Genetic Assembly System (Bestellnr. A13285).

Einfache und schnelle Klonerstellung
GeneArt™ Seamless Cloning ist ein einfacher, aus zwei Schritten bestehender Prozess, der eine röhrchenbasierten Aneinanderreihungsreaktion gefolgt von Transformation in One Shot™ Chemically Competent TOP10 E. coli umfasst. Das Kit verwendet die Eigenschaften eines proprietären enzymatischen Gemischs für die Aneinanderreihung von DNA-Fragmenten mit entsprechender Homologie der terminalen Enden ohne zusätzliche Sequenzen oder Narben zu hinterlassen (nahtlos). Ein Teil der Aneinanderreihungsreaktion wird dann in die mitgelieferten kompetenten TOP10-Zellen transformiert, wodurch am nächsten Tag Klone für die Analyse bereit sind. Die erforderliche 15-Basen-Endhomologie kann einfach durch PCR-Amplifikation mit kundenspezifischen DNA-Oligos entwickelt werden.

Klonierungseffizienz, Flexibilität und Präzision
Mit dem GeneArt™ Assemblierungs-Kit für die nahtlose Klonierung sind die Größe der DNA-Elemente (100 bp bis 5 kb), die Gesamtgröße des Endmoleküls (≤ 13 kb) sowie die Qualität und Spezifität des Fragments die Hauptfaktoren für die Effizienz des Kloniervorgangs. Das terminale Ende der PCR-Fragmente (A-Überhänge oder Stumpf) hat keinen Einfluss auf die Klonierungseffizienz.

Typische Klonierungswirkungsgrade für unterschiedliche Fragmentmengen, die in den pUC19L Vektor geklont werden, sind:
• 90 % für ein einzelnes 5 kb-DNA-Element
• 70 % für 4 Fragmente mit je 1 kb
• 40 % für 4 DNA-Fragmente mit je 2 kb

Der Erfolg der Klonierung ist unabhängig von Insertsequenz und Vektortyp. Sie können also nahezu jede gewünschte Sequenz oder Sequenzkombination erstellen und einem Plasmid hinzufügen, solange es entweder durch Restriktionsenzymverdau oder PCR linearisiert werden kann. Die durch die Reaktion erhaltenen zirkulierten Klone enthalten nur die Sequenz Ihres ursprünglichen Vektors, Inserts und designierte Homologien ohne überflüssige Nucleotid-Einfügungen.

In silico Klonierungs-Design-Support
Ein wichtiger Schritt bei GeneArt™ nahtloser Klonierung ist das richtige Design von Fragmenten und Oligos mit der entsprechenden Homologie und dem passenden Abstand, um eine erfolgreiche Assemblierung Ihres Klons zu gewährleisten. Zur Vereinfachung und Beschleunigung des Designprozesses bieten wir ein kostenloses Online-Tool als Hilfsmittel bei der Planung Ihres In-silico-Experiments. Das Tool prüft die Kompatibilität des experimentellen Designs mit den Produktspezifikationen, entwirft DNA-Oligos mit Endhomologie für die PCR-Amplifikation der verschiedenen zu klonenden Elemente. Außerdem präsentiert es dem Anwender eine grafische Darstellung des Vektors sowie eine herunterladbare kommentierte Sequenz im GenBank Format, die mit der Vector NTI™ Software kompatibel ist.

Anwendungen
Das GeneArt™ Kit für die nahtlose Klonierung und Assemblierung wurde entwickelt, um unter anderem Klonierungen und DNA-Assembly-Experimente in zahlreichen Anwendungen in der Molekularbiologie und synthetischen Biologie zu ermöglichen. Das Produkt ermöglicht die Erstellung von modularen Expressionsvektoren mit austauschbaren Teilen und kann für die Ausführung einer Vielzahl verschiedener Aufgaben verwendet werden, die sonst mehrere Schritte umfassen. Das Kit eignet sich für die problemlose Herstellung von Fusionsproteinen, die Entfernung, den Austausch oder die Addition von DNA-Elementen wie Restriktionsstellen in einem vorhandenen Vektor sowie für viele andere Verfahren, die eine Manipulation der genetischen Sequenzen erfordern.