Precision gRNA Synthese-Kit

Das Precision gRNA Synthesis Kit ist ein komplettes System für die schnelle Synthese von Guide-RNA (gRNA), die mit TrueCut™ Cas9 Protein v2 für transfektionsbereite Cas9-Proteine/gRNA Ribonukleoprotein (Cas9 RNP) komplex ist. Dieses Cas9 RNP-Format mit unserem TrueCut Cas9-Protein v2 wurde in einer Vielzahl von Suspensions- und adhärenten Zelllinien mit einer Spaltungseffizienz von > 70 % und ohne Anzeichen von Toxizität getestet. Beginnend mit zwei kurzen einsträngigen Oligos, die für die Zielsequenz codieren, wird das gRNA-Template in einer kurzen ‘One-Pot’-PCR-Reaktion mit einem T7-Promoter zusammengesetzt. Das entstandene Produkt wird dann als Template in einer In-vitro-Transkription (IVT) verwendet und durchläuft anschließend eine schnelle Aufreinigung, die in nur vier Stunden transfektionsbereite gRNA liefert. Die daraus resultierende gRNA kann auch mit unserer gebrauchsfertigen Invitrogen™ CRISPR Nuklease-mRNA kontransfiziert werden. Weder das Protein- noch das mRNA-Cas9-Format erfordert eine Plasmidmanipulation, wodurch beide für den Einsatz in Hochdurchsatzverfahren sowie in Multiplex-Verfahren mit genomweiter Zellmanipulation geeignet sind.

Merkmale des Precision gRNA Synthesis Kit:
• Schnelle Zusammenstellung und Synthese von beliebigen gRNA-Zielen in nur vier Stunden einschließlich Template-Assemblierung
• Hohe Ausbeute (> 10 μg) und Konzentration (> 200 ng/μl) von gRNA

Herstellung einer gRNA-Sequenz
Genome-Editing mit CRISPR-Technologie erfordert eine nichtcodierende Guide-RNA (gRNA), um genomische DNA an einer Zielsequenz von Interesse zu spalten. Die gRNA hat zwei molekulare Komponenten: Eine zielspezifische CRISPR RNA (crRNA) und eine trans-aktivierende crRNA (tracrRNA), die zu einem Transkript zusammengefasst wurden. Die Zielsequenz (20 Basen) muss unmittelbar vor einem PAM-Motiv (NGG) liegen, das es dem Cas9 ermöglicht, eine Bindung zu initiieren. Der PAM befindet sich nur auf der Ziel-DNA und ist nicht Teil der zielspezifischen CRISPR-Sequenz. Die gRNA und das PAM-Motiv leiten die Cas9-Nuklease zur Genomsequenz des Ziels, um einen Komplex zu bilden und einen doppelsträngigen stumpfen DNA-Bruch (DSB) von drei Nukleotiden stromaufwärts von der PAM-Position zu erzeugen.

Verwenden Sie unser CRISPR Such- und Design-Tool, um unsere Datenbank mit > 600.000 gRNA-Sequenzen zu durchsuchen, die für jedes Gen im Genom des Menschen und der Maus spezifisch sind. Vorentwickelte Invitrogen-gRNAs sind für Gen-Knockout optimiert und auf die ersten drei transkribierten Exons für jedes Gen ausgerichtet. Die Suchergebnisse enthalten Empfehlungen, die auf der Minimierung potenzieller Off-Target-Effekte, potenzieller Bindungsstellen und Exon-Karten mit gRNA-Positionen basieren. Dieses Tool kann auch zur Analyse beliebiger Sequenzen verwendet werden, um eindeutige CRISPR-Sequenzen zu entwerfen.

So stellen Sie gRNA her
Sobald gRNA-Sequenzen ausgewählt wurden, wählen Sie aus drei Optionen für die Herstellung von gRNA:
1. TrueGuide Synthetic Guide RNA— Wählen Sie aus unserem Katalog vorgefertigter gRNAs oder laden Sie Ihre Sequenz in unser TrueGuide gRNA Ordering Tool hoch
2. Precision gRNA Synthesis Kit (diese Seite)—für transfektionsfähige gRNA in nur vier Stunden inklusive Template-Assembly
3. Genom Engineering — Sparen Sie Zeit und Aufwand und lassen Sie sich von unserem kundenindividuellen Service-Team für Sie in vitro transkribierte (IVT) gRNA-Sequenzen entwerfen, synthetisieren und reinigen. Um ein Serviceangebot zu erhalten oder zu bestellen, wenden Sie sich bitte an unsere Custom Services Abteilung unter 1-800-955-6288 x45682 oder gemservices@thermofisher.com.