Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay

Der Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay ist Teil einer Komplettlösung, mit der mehrere Ziele in tumorabgeleiteter DNA und RNA nachgewiesen werden können, die aus dem Plasmaanteil von Vollblut isoliert wurden. Der Assay stellt die Reagenzien und einen einzelnen Pool von Multiplex-PCR-Primern für die Erstellung einer Amplikon-Bibliothek aus zellfreier Gesamt-Nukleinsäure (cfTNA) bereit, die aus dem Plasmaanteil eines einzelnen 10-ml-Vollblutröhrchens gewonnen wird. Diese Bibliothek kann dann für eine hochmultiplexe zielgerichtete Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) verwendet werden.

Vorteile des Oncomine Cell-Free Assays:
• Erzeugt aus einem einzelnen Blutröhrchen eine Amplikon-Bibliothek aus DNA und RNA mit einer Nachweisgrenze von 0,1 % für SNVs
• Amplikon-Größe, die für kurze cfDNA optimiert ist, was eine höchstmögliche Erfassungsrate gewährleistet
• Die Tag-Sequenzierungstechnologie minimiert Fehlalarme durch Entfernen zufällig eingespielter Fehler
• Optimierte zielgerichtete Assay-Konstruktion ermöglicht hochgradig multiplexte NGS, wodurch die Sequenzierungskosten pro Probe reduziert werden
• Zweitägiger Arbeitsablauf von einem einzelnen 10 ml-Blutröhrchen für Bericht; die Gesamtzeit für zielgerichtete Bibliotheken beträgt nur vier Stunden
• Ermöglicht krebsgenetische Studien von nur 5 ng Eingabe-cfTNA
• Kompatibel mit FFPE-Proben für mögliche Konkordanzstudien

Das 52-Gen-Panel umfasst:
• Hotspot-Genen (SNVs) und kurze Indels: AKT1, ALK, AR, ARAF, BRAF, CHEK2, CTNNB1, DDR2,EGFR, ERBB2, ERBB3, ESR1, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT3, GNA11, GNAQ, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MTOR, NRAS, NTRK1, NTRK3, PDGFRA, PIK3CA, RAF1, RET, ROS1, SF3B1, SMAD4, SMO
• Genfusionen: ALK, BRAF, ERG, ETV1, FGFR1, FGFR2, FGFR3, MET, NTRK1, NTRK3, RET, ROS1
• MET Exon 14 Überspringen
• Kopienzahlgene (CNVs): CCND1, CCND2, CCND3, CDK4, CDK6, EGFR, ERBB2, FGFR1, FGFR2, FGFR3, MET, MYC
• Tumorsuppressorgene: APC, FBXW7, PTEN, TP53

Diese Gene wurden als häufig mutiert in verschiedenen Krebsarten identifiziert, einschließlich: Blase, Gehirn und ZNS, Brust, zervikal, kolorektal, endometrial, ösophageal, gastrisch, Kopf und Hals, Nieren, Leber, Lunge, Melanom, Ovarialkarzinom, Bauchspeicheldrüse, Prostata, Sarkom und Schilddrüse.

Nachweisgrenzen:
• SNVs/kurze Indels: Eine Nachweisgrenze (LOD) von bis zu 0,1 % Allelfrequenz (AF) kann mit einer Empfindlichkeit von > 80 % und einer Spezifität von > 98 %*
• TP53 Ganzziel-SNVs/Indels erreicht werden: 0,5 % AF (bei Betrachtung aller Basen in Amplikonen)
• Überspringen von MET Exon und MET Exon: LOD bis zu 1 % können erreicht werden
• CNV-Ziele: Nachweis bis zum 1,4-fachen Wechsel möglich

Das MagMAX Cell-Free Total Nukleinsäure-Isolationskit (A36716) wird für die Isolierung von DNA und RNA aus der Plasmafraktion von Vollblut dringend empfohlen.

Skalierbarkeit und Flexibilität werden erreicht mit dem Tag Sequencing Barcode Set 1-24 oder 25-48 (Kat Nr. A31830 bzw. A31847) zum Multiplexen von Proben mit Barcode auf den Ion S5 Chips.

Die Analyse von SNVs und kurzen Indels kann mit Torrent Suite Software 5.2 oder höher erreicht werden. Für die Analyse von SNVs, kurzen Indels, Fusionen und CNVs ist Ion Reporter Software 5.6 (cloud- oder serverbasiert) erforderlich.

Technologie
cfDNA und cfRNA werden bei extrem niedrigen Konzentrationen im Plasmaanteil von Vollblut gefunden. Aufgrund dieser niedrigen Prävalenz wird in diesem Assay eine Tag-Sequenzierungstechnologie verwendet. Die Technologie verbindet einzigartige molekulare Tags mit den genspezifischen Primern. Nach der Amplifikation werden die markierten Moleküle anhand der Tags gruppiert. Gruppen mit derselben Mutantenvariante 80 % der Zeit oder mehr werden als positiv bezeichnet. Mithilfe der Tag-Technologie werden Gruppen entfernt, die zufällige Fehler enthalten, die durch den Aufbau-/Sequenzierungsprozess der Bibliothek generiert wurden.

Im Gegensatz zu anderen Technologien mit LODs von 1-5 % hat der Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay eine flexible Nachweisgrenze von bis zu 0,1 % für SNVs oder eine Mutantenkopie im Hintergrund von 1.000 Wildtypkopien. Um eine Nachweisgrenze (LOD) von 0,1 % zu erreichen, sind 20 ng Input-cfTNA erforderlich. Es können niedrigere Mengen cfTNA verwendet werden, aber die %LOD-Werte sind je nach Input-Menge höher.

Flüssige Biopsien bieten gegenüber herkömmlichen festen Tumorbiopsien mehrere Vorteile:
• Flüssige Biopsieproben sind weniger invasiv und können an mehreren Zeitpunkten entnommen werden, um das Fortschreiten des Krebses
• zu überwachen. Niedrigere Kosten im Vergleich zu herkömmlichen Gewebiopsien
• Schnellere Durchlaufzeit von Probe zu Ergebnissen
• Bessere Darstellung der Tumorheterogenität

*Empfindlichkeit und Spezifität für jeden Variantentyp wurden bestimmt mit einer Sammlung von positiven, mit Geweben versehenen Proben und cfTNA, die von normalen gesunden Spendern isoliert wurde.