Click-iT™ Nascent RNA-Capture-Kit für die Genexpressionsanalyse

Das Click-iT™ Nascent RNA-Capture-Kit nutzt unsere proprietäre Click-iT™ Chemie, um neu entstandene RNA mit hoher Effizienz und Sensitivität zu erfassen. Die Click-iT™ Technologie ermöglicht hochauflösende Analysen der Genregulation, darunter RNA-Regulation, RNA-Stabilität, RNA-Synthese, RNA-Zerfall und -Abbau, transkriptionelle Regulierung, delta⁄delta C(t), nukleäre Run-on⁄Run-off-Transkription und mehr. Den Zellen bzw. dem Gewebe wird Ethylenuridin (EU) verabreicht, ein Ribonukleotid-Homolog mit einer alkinreaktiven Gruppe. Nach der Aufnahme in die Zellen diese lysiert und die RNA isoliert. Ein Biotinazid wird „angeklickt“, woraufhin der neu synthetisierte RNA-Pool an Strepavidin-Magnetbeads gebunden wird. Die aufgefangenen RNAs werden dann amplifiziert, und die daraus resultierenden cDNAs können in verschiedenen Downstream-Applikationen eingesetzt werden. Wir haben das Produkt für Arrays validiert (hohe und niedrige Dichte): Sequenzierung auf SOLiD™ und entweder SYBR™ oder TaqMan™ basierter qPCR und qPCR-basierte Delta-CT-Analyse. Lediglich 25.000 Zellen sind für die Analyse der neu induzierten Transkripte erforderlich. Das Kit erlaubt 40 mögliche Versuchsbedingungen für Markierung und Bindung, die wiederum in 400 separate analytische Assays aufgeteilt werden können. Mit einem Preis von etwa einem Dollar pro Assay ist dieses Produkt für Forscher an Hochschulen und in der Industrie perfekt geeignet.

Das EU-Reagenz wird in der empfohlenen Konzentration von 200 µM von den Zellen gut toleriert. Bei einem Array-Screening von mehr als 32.000 Genen konnten wir lediglich marginale Änderungen bei 12 Genen im Vergleich zur Kontrolle feststellen. Ferner gab es bei einer anfänglichen Verabreichung, die der fünffachen der von uns empfohlenen Konzentration entsprach (200 µM vs. 1,0 mM), keine Auswirkungen auf eine Reihe von Haushaltsgenen sowie auf die Fähigkeit zu normaler Zellproliferation. Sensitivität und Zuverlässigkeit wurden in einem Low-Density-Array (TLDA™) mit apoptotischen Genen bestätigt. Der gebundene neu entstandene Pool enthielt alle zuvor charakterisierten apoptotischen (Stauroporin-induziert) Transkripte ohne erkennbare Änderungen der Sequenzinformationen.

*Entdecken anstelle von Wiedergewinnen.* Die letzten Jahrzehnte in der Genomik ergaben, dass nur 2 % des menschlichen Genoms Proteine codieren. Demnach bestehen 98 % des menschlichen Genoms aus nicht-codierenden Sequenzen. Die Entdeckung der Aufgabe und der Expressionsmuster dieses enormen Reservoirs unbekannter Sequenzen wird durch diesen neuen Ansatz und die Transkriptomik dieses Jahrzehntes erheblich unterstützt.

*Fähigkeit, die RNA-Stabilität zu untersuchen. * Für andere wird die Fähigkeit, die Stabilität von mRNAs ohne Radioaktivität untersuchen zu können, eines der der hier angebotenen Schlüsselmerkmale sein. In der Vergangenheit wurden Halbwertszeiten von Transkripten mit Hilfe von radioaktiven Nukleotiden in herkömmlichen nukleären Run- und Run-off-Experimenten abgeleitet. Dieser mühsame und gefahrenträchtige Ansatz ist stark im Rückgang begriffen – jetzt können diese entscheidenden Werte simpel, sicher und zuverlässig gewonnen werden.

*Was ist neu?* Beziehen Sie die Click-iT-Produktlinie metabolischer Analoga zur Markierung neuer Materialien mit ein! Ohne Radioaktivität oder schwierig anzuwendende Haptene. Bleiben Sie auf dem neusten Stand in den Bereichen DNA, RNA, Proteine, Zucker, PTMS und mehr.
*Click-iT™ Technologie – Eine Reaktion, endlose Möglichkeiten!*