Ensayo de proliferación Click-iT™ EdU para microplacas

El ensayo de proliferación Click-iT EdU para microplacas proporciona un método más simplificado y sólido para la medición de la proliferación de células de mamíferos en comparación con los métodos tradicionales basados en BrdU. Tras la incorporación de EdU (un análogo de timidina modificado) en el ADN recién sintetizado, la peroxidasa de rábano picante (HRP) se une covalentemente a través de la reacción de clic altamente específica. A continuación, se añade el reactivo Amplex UltraRed, un sustrato de HRP, y se detecta la señal de fluorescencia resultante. Debido a la unión altamente específica de HRP a EdU, este ensayo da como resultado una medición altamente sensible y fiable de la proliferación de células de mamíferos en un formato de microplaca.

Las características del ensayo de proliferación Click-iT EdU para microplacas incluyen:
• Rendimiento mejorado: la conjugación directa de HRP con EdU incorporada mejora la sensibilidad y precisión del ensayo
• Mayor fiabilidad: el formato del ensayo da como resultado una baja variabilidad de pocilllo a pocillo
• Protocolo simplificado: da como resultado una reducción del tiempo de salida de los datos; seguimiento más sencillo del protocolo
• Multiplexing habilitado: se puede realizar fácilmente el multiplexing del ensayo con otros reactivos de salud celular, lo que da como resultado más datos por muestra

La medición de la proliferación celular es un método fundamental para evaluar la salud celular, determinar la genotoxicidad y evaluar la investigación de fármacos anticancerígenos. El método más preciso para medir la proliferación es la detección directa de la síntesis de ADN. Originalmente, este procedimiento se realizaba mediante la incorporación de un nucleósido radiactivo (p. ej., la ³H-timidina). Este método fue reemplazado por la detección basada en anticuerpos del análogo nucleósido bromodesoxiuridina (BrdU). Tras la incorporación de BrdU en el ADN recién sintetizado, se requiere la desnaturalización para exponer las moléculas de BrdU al anticuerpo anti-BrdU. La desnaturalización implica métodos extremos (HCl, calor o enzimas) y requiere mucho tiempo y es difícil de realizar de manera constante.

El ensayo de proliferación Click-iT EdU es una alternativa al ensayo BrdU. El análogo nucleósido EdU (5-etinil-2´-desoxiuridina) se añade a las células vivas y se incorpora al ADN durante la síntesis activa del mismo. La EdU incorporada contiene un grupo de alquinos que se une covalentemente al grupo de azidas presente en el HRP mediante una reacción covalente altamente específica catalizada por el cobre (“reacción de clic”). A continuación, se añade el reactivo Amplex UltraRed y su conversión por HRP en un producto altamente fluorescente se registra mediante un lector de microplacas de fluorescencia (excitación: 568, emisión: 585 nM). Con un alto coeficiente de extinción, una buena eficiencia cuántica y resistencia a la autooxidación, el reactivo Amplex UltraRed proporciona una mayor sensibilidad y un rango de ensayo más amplio que otros sustratos de HRP fluorogénicos o colorimétricos. También ofrece versatilidad a través de la detección mediante medición de fluorescencia o absorbancia.

En comparación con los ensayos de proliferación de microplacas basados en anti-BrdU, el ensayo de proliferación Click-iT EdU utiliza pequeñas porciones de reacción y no requiere anticuerpos ni desnaturalización del ADN, los cuales pueden reducir el rendimiento del ensayo. Además, no se requiere la unión de estreptavidina-biotina, lo que elimina los pasos necesarios de bloqueo de biotina requeridos por las células que poseen altos niveles de biotina endógena.