Click-iT™ EdU-Proliferationsassay für Mikrotiterplatten

Der Click-iT EdU-Proliferationsassay für Mikrotiterplatten stellt eine einfachere und robustere Methode zur Messung der Zellproliferation von Säugetieren im Vergleich zu herkömmlichen BrdU-basierten Methoden dar. Nach dem Einbau von EdU (einem modifizierten Thymidin-Analogon) in die neu synthetisierte DNA wird Meerrettich-Peroxidase (HRP) über die hochspezifische Click-Reaktion kovalent angehängt. Amplex UltraRed Reagenz, ein HRP-Substrat, wird hinzugefügt und das resultierende Fluoreszenzsignal wird erkannt. Aufgrund der hochspezifischen Bindung von HRP an EdU ermöglicht dieser Assay eine hochempfindliche und zuverlässige Messung der Zellproliferation von Säugetieren in einem Mikrotiterplattenformat.

Der Click-iT EdU-Proliferationsassay für Mikrotiterplatten bietet folgende Funktionen:
• Besseres Leistungsverhalten—Die direkte Konjugation von HRP an inkorporiertes EdU verbessert die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Assays
• Höhere Zuverlässigkeit—Das Assay-Format hat eine geringe Well-to-Well-Variabilität zur Folge
• Vereinfachtes Protokoll—kürzere Zeit bis zur Datenerfassung; einfacheres Befolgen des Protokolls
• Multiplex-fähig—Der Assay kann leicht mit anderen Zellgesundheitsreagenzien gemultiplext werden, was zu mehr Daten pro Probe führt

Die Messung der Zellproliferation ist eine grundlegende Methode zur Beurteilung der Zellgesundheit, zur Bestimmung der Genotoxizität und zur Bewertung von Krebsmedikamenten. Die genaueste Methode zur Messung der Proliferation ist der direkte Nachweis der DNA-Synthese. Früher wurde dies durch die Einbindung eines radioaktiven Nukleosids (z. B. ³H-Thymidin) erreicht. Diese Methode wurde durch die Antikörper-basierte Erkennung des Nukleosid-Analogons Bromdesoxyuridin (BrdU) ersetzt. Nach der Einbindung von BrdU in die frisch synthetisierte DNA ist eine Denaturierung erforderlich, um die BrdU-Moleküle dem Anti-BrdU-Antikörper auszusetzen. Die Denaturierung umfasst rauhe Verfahren (HCl, Hitze oder Enzyme), ist zeitaufwändig und schwierig konsistent durchzuführen.

Der Click-iT EdU-Proliferationsassay ist eine Alternative zum BrdU-Assay. Das nukleosidanaloge EdU (5-Ethynyl-2´-desoxyuridin) wird lebenden Zellen hinzugefügt und während der aktiven DNA-Synthese in die DNA integriert. Das integrierte EdU enthält eine Alkin-Gruppe, die kovalent mit der in HRP vorhandenen Azid-Gruppe verbunden ist, wobei eine hochspezifische kupferkatalysierte kovalente Reaktion („Klick-Reaktion“) zum Einsatz kommt. Dann wird Amplex UltraRed Reagenz hinzugefügt und seine Umwandlung durch HRP in ein stark fluoreszierendes Produkt mit einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät aufgezeichnet (Anregung: 568 nm, Emission: 585 nm). Mit seinem hohen Extinktionskoeffizienten, seiner guten Quanteneffizienz und seiner Resistenz gegen Autooxidation sorgt das Amplex UltraRed Reagenz für eine höhere Empfindlichkeit und einen breiteren Assay-Bereich als andere fluorogene oder kolorimetrische HRP-Substrate. Es ist außerdem vielseitig, da der Nachweis entweder durch Fluoreszenz- oder durch Absorptionsmessung erfolgen kann.

Im Vergleich zu Anti-BrdU-basierten Mikrotiterplatten-Proliferationsassays verwendet der Click-iT EdU-Proliferationsassay kleine Reaktionseinheiten und erfordert keine Antikörper oder DNA-Denaturierung, die beide die Assayleistung mindern können. Außerdem ist keine Streptavidin-Biotin-Bindung erforderlich, wodurch die erforderlichen Biotin-Blockierschritte entfallen, die bei Zellen mit hohem endogenen Biotin erforderlich sind.