T-REx™ Core Kit, with pcDNA™4/TO Vector

Citas y referencias (4)

Invitrogen™

T-REx™ Core Kit, with pcDNA™4/TO Vector

Sistema de expresión regulado por tetraciclina sin transactivadores viralesEl sistema T-REx™ produce niveles más altos de expresión inducida que cualquierMás información

Número de catálogo	Cantidad
K102002 también denominado K1020-02	1 kit

Número de catálogo K102002

también denominado K1020-02

Precio (MXN)

Cantidad:

1 kit

Sistema de expresión regulado por tetraciclina sin transactivadores viralesEl sistema T-REx™
produce niveles más altos de expresión inducida que cualquier otro sistema de expresión de mamíferos regulado. Utiliza el promotor de CMV completo y añade elementos de control al operón de resistencia bacteriana a la tetraciclina para reprimir eficazmente y volver a reprimir la transcripción de una de las secuencias promotoras de mamíferos más fuertes que se conocen (1,2).

Activación específica
El sistema T-REx ™ utiliza un mecanismo represor que bloquea la transcripción del poderoso promotor del CMV en ausencia de tetraciclina. Debido a que los elementos del sistema T-REx™ no utilizan transactivadores virales, puede lograr una expresión de alto nivel a partir de un promotor del CMV completo sin la activación secundaria y no específica de los genes anfitriones.

Mecanismo T-REx™
Los elementos de control transcripcional T-REx™ se ilustran en la Figura 1. Se han insertado dos secuencias de operador de tetraciclina (TetO₂) entre la caja TATA del promotor de CMV y el sitio de inicio transcripcional: La secuencia de TetO₂ en sí no tiene efecto en la expresión. Cuando la proteína represora de tetraciclina (TR) está presente, se une eficazmente a los sitios de TetO₂ y bloquea el inicio de la transcripción La tetraciclina añadida al medio de cultivo se une a la proteína TR y cambia su conformación. Este cambio hace que la proteína TR libere los sitios de TetO₂, lo que reduce la transcripción del promotor del CMV. El resultado es una expresión de alto nivel del gen de interés (Figura 2). Los niveles de expresión se pueden modular en función de la concentración de tetraciclina y pueden inducirse a niveles que se logran con vectores de expresión CMV constitutiva.

T-REx™ es un potente sistema de expresión de mamíferos inducible que permite regular la expresión de un potenciador-promotor del citomegalovirus (CMV). Los vectores de expresión inducible T-REx™ofrecen las siguientes funciones:

• Secuencia completa del potenciador-promotor de CMV que contiene dos copias de la secuencia de operador de tetraciclina TetO₂ para una expresión regulada de alto nivel
• Zeocin™ o el gen de resistencia a la higromicina para la selección eficaz de líneas de células de mamíferos estables
• Sitio de clonación múltiple de gran tamaño para simplificar la clonación

Además, pcDNA™4/TO/myc-His ofrece un epítopo c-myc para una detección rápida de proteínas recombinantes con un anticuerpo Anti-myc y una secuencia de polihistidina (6xHis) para una purificación sencilla de la proteína recombinante con resina quelante de níquel y una detección con el anticuerpo Anti- His(C-terminal).

Vector regulador, pcDNA™6/TR, proporcionado para la expresión de alto nivel de la proteína represora de tetraciclina (TR). Este vector expresa el gen de resistencia a la blasticidina para una selección rápida de líneas de células de mamíferos que expresan la proteína TR de forma estable.

Para uso exclusivo en investigación. No apto para uso en procedimientos diagnósticos.

Especificaciones

Sistema constitutivo o inducibleInducible

Tipo de entregaTransfección

Para utilizar con (aplicación)Expresión regulada

Agente inductorTetraciclina

Tipo de productoKit de clonación de núcleo T-Rex con vector

Cantidad1 kit

Agente de selección (eucariótico)Zeocin™, blasticidina

VectorpcDNA

Método de clonaciónEnzimas de restricción/MCS

Línea de productosGateway, T-REx, pcDNA

PromotorCMV/TO

Etiqueta de proteínaSin etiquetar

Unit SizeEach

Contenido y almacenamiento

El kit básico de T-REx™ incluye 20μg cada uno de pcDNA™4/TO o 20μg cada uno de pcDNA™ 4/TO/myc-His A, B y C; un vector de control positivo, pcDNA™6/TR y cebadores de secuenciación directa e inversa

.Todos los vectores son superenrollados y se suministran liofilizados.

Conservar todos los componentes a -20°C. Se garantiza la estabilidad de todos los componentes durante 6 meses si se almacenan correctamente.

Preguntas frecuentes

Why is sequential transfection recommended over co-transfection in the T-REx and GeneSwitch systems?

When a co-transfection is performed, there is no way of testing the double stable cell line for functional TetR or GeneSwitch protein, respectively. On the other hand, when sequential transfection is performed, one can functionally test the generated T-REx or GeneSwitch cell line by transiently transfecting the lacZ expression control plasmid and then picking a clone that shows the lowest basal level of expression of lacZ in the absence of the inducer, and the highest level of lacZ in the presence of the inducer. This clone can then be expanded and used to transfect the T-REx or GeneSwitch expression construct, as the case may be.

What is the main advantage of the GeneSwitch system over the T-REx system? And what is its main disadvantage?

With the GeneSwitch system, it is possible to have the absolute lowest basal levels of expression of the gene of interest, whereas the T-REx system may be a little leaky due to the inevitable presence of tetracycline in FBS. The induced level of expression in the GeneSwitch system can be even higher than that seen with the CMV promoter. The disadvantage of the GeneSwitch system is that the expression does not appear to switch off very easily in culture, although it has been demonstrated to function beautifully in transgenics. The T-REx system, on the other hand, can be switched on and off by the addition and removal of the inducer.

What is the advantage of the Flp-In T-REx system over the T-REx system?

The Flp-In T-REx system combines the targeted integration offered by the Flp-In system with the powerful inducible expression offered by the T-REx system. It allows generation of isogenic, inducible, stable cell lines and permits polyclonal selection of these cell lines. Once the Flp-In T-REx host cell line containing an integrated FRT site has been created, subsequent generation of Flp-In T-REx cell lines expressing the gene(s) of interest is rapid and efficient.

Can I use doxycycline instead of tetracycline as an inducer in the T-REx system?

Doxycycline may be used as an alternative inducing agent in the T-REx system. It is similar to tetracycline in its mechanism of action, and exhibits similar dose-response and induction characteristics as tetracycline in the T-REx system. Doxycycline has been shown to have a longer half-life than tetracycline (48 hours vs. 24 hours, respectively). We do not offer doxycycline, but it may be obtained from Sigma (Cat. No. D9891).

I am planning to generate a T-REx cell line using pcDNA6/TR. Can I perform a western blot using antibodies to TetR to assess whether the cell line is expressing enough of TetR? Do you offer an antibody to TetR?

We do not offer an anti-TetR antibody. Even though a western using an anti-TetR antibody can be used to screen out clones that do not express any TetR protein, it would not be the optimal way to screen for functional clones. Functional testing by performing a transient transfection with the lacZ expression control plasmid is recommended for this purpose, followed by picking a clone that shows lowest basal levels of expression of beta-galactosidase in the absence of tetracycline, and highest levels of beta-galactosidase expression upon addition of tetracycline.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our Protein Expression Support Center.

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Citations & References (4)

Citations & References

Abstract

Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.

Authors:Tate CG, Haase J, Baker C, Boorsma M, Magnani F, Vallis Y, Williams DC,

Journal:Biochim Biophys Acta

PubMed ID:12586388

'The rat serotonin transporter (rSERT) is an N-glycosylated integral membrane protein with 12 transmembrane regions; the N-glycans improve the ability of the SERT polypeptide chain to fold into a functional transporter, but they are not required for the transmembrane transport of serotonin per se. In order to define the best ... More

Effect of some aldoses on growth of Saccharomyces cerevisiae inhibited with molybdenum.

Authors:Zemek J, Bílik V, Zákutná L,

Journal:Folia Microbiol (Praha)

PubMed ID:285

The inhibitory effect of molybdenum ions on growth of yeasts at pH 5.5 was found to be decreased by aldoses in the following order: D-talose greater than L-mannose greater than L-ribose greater than D-lyxose greater than L-galactose greater than L-arabinose greater than L-glucose greater than L-xylose. Increased concentrations of molybdenum ... More

Human TRPC5 channel activated by a multiplicity of signals in a single cell.

Authors:Zeng F, Xu SZ, Jackson PK, McHugh D, Kumar B, Fountain SJ, Beech DJ,

Journal:J Physiol

PubMed ID:15254149

Here we explore the activation mechanisms of human TRPC5, a putative cationic channel that was cloned from a region of the X chromosome associated with mental retardation. No basal activity was evident but activity was induced by carbachol stimulation of muscarinic receptors independently of Ca2+ release. This is 'receptor activation', ... More

The gamma -secretase-cleaved C-terminal fragment of amyloid precursor protein mediates signaling to the nucleus.

Authors: Gao Y; Pimplikar S W;

Journal:Proc Natl Acad Sci U S A

PubMed ID:11742091

Sequential processing of the amyloid precursor protein (APP) by beta- and gamma-secretases generates the Abeta peptide, a major constituent of the senile plaques observed in Alzheimer's disease. The cleavage by gamma-secretase also results in the cytoplasmic release of a 59- or 57-residue-long C-terminal fragment (Cgamma). This processing resembles regulated intramembrane ... More