Kit de carga de LiveBLAzer™ FRET-B/G con CCF2-AM

Antecedentes:
Los ensayos basados en células de GeneBLAzer™ utilizan las formas de ésteres permeables a la membrana (CCF2-AM y CCF4-AM) de los sustratos fluorescentes de betalactamasa con carga negativa, CCF2 y CCF4. Estos ésteres lipofílicos entran fácilmente en la célula, donde la escisión por parte de las esterasas citoplasmáticas endógenas los convierte rápidamente en sus formas cargadas negativamente, atrapándolos así en el citosol.

Los ensayos de detección GeneBLAzer™ están basados en FRET. Cada sustrato está marcado con dos fluoróforos que forman un par de FRET eficiente. En ausencia de actividad de la betalactamasa, la excitación de la cumarina a 409 nm en la molécula CCF2 intacta da lugar a FRET en la fluoresceína, que emite una señal de fluorescencia verde a 518 nm (Figura 1). Sin embargo, en presencia de actividad betalactamásica, la escisión de CCF2 separa espacialmente los dos colorantes y altera la FRET, de modo que la excitación de la cumarina a 409 nm produce ahora una señal de fluorescencia azul a 447 nm. Esta señal azul puede observarse fácilmente bajo un microscopio y también puede detectarse como un aumento en la lectura del canal azul en lectores de microplacas fluorescentes.

Los sustratos CCF2-AM y CCF4-AM son componentes esenciales del ensayo para la plataforma GeneBLAzer™. Estos sustratos son totalmente compatibles con la citometría de flujo, lo que acelera el tiempo de selección de clones. El análisis radiométrico de las señales azules y verdes reduce la variación de pozo a pozo debido a las diferencias en el números de células y la carga de sustrato, lo que conduce a altos valores de factor´Z y bajos coeficientes de variación (CV).

CCF2-AM y CCF4-AM difieren en dos carbonos en el enlace que une la fracción de cumarina con el anillo de lactama. Ambos se encuentran en las formas esterificadas permeables a la membrana y pueden usarse para ensayos en células intactas. El CCF4-AM tiene mejores propiedades de solubilidad (soluble durante >24 horas) que el CCF2-AM y, por lo tanto, es más adecuado para aplicaciones de cribaje. Además, el CCF4-AM tiene una FRET ligeramente mejor y, por lo tanto, un fondo ligeramente más bajo que el CCF2-AM.

El CCF2-FA es esencialmente el sustrato CCF2 sin los ésteres que se encuentran en la versión AM. El CCF2-FA se desesterifica y se utiliza en aplicaciones de lisado celular, lo que evita la carga a través de la membrana celular y los pasos de desesterificación. Los lisados celulares son el método preferido para las aplicaciones que utilizan células que contienen una pared celular. El CCF2-FA también puede usarse como control para adquirir los espectros de excitación y emisión de CCF2-AM y CCF4-AM.