GeneSwitch™ Mammalian Expression Kit, complete kit

Expression Switch-On à partir des niveaux basaux les plus bas
Le système GeneSwitch™ pour l’expression de cellules de mammifères inductible est idéal pour les expériences qui nécessitent les niveaux d’expression non induits les plus bas. Le vecteur d’expression pGene / V5-His fournit un promoteur minimal, GAL4-E1b, composé de sites de liaison pour la protéine de liaison de l’ADN Gal4 de levure, suivi de la séquence TATA du promoteur de l’adénovirus E1b. Sans facteurs supplémentaires, le promoteur GAL4-E1b est transcriptionnellement silencieux.

Pour activer la transcription à partir du promoteur GAL4-E1b, la protéine régulatrice GeneSwitch™ est exprimée à partir du promoteur TK minimal sur le vecteur pSwitch. La protéine GeneSwitch™ possède trois domaines fonctionnels :

• Le domaine de liaison à l’ADN Gal4 (Gal4-DBD) pour lier la protéine régulatrice au promoteur GAL4-E1b
• Le domaine de liaison du ligand du récepteur de la progestérone humaine tronqué (HPR-LBD) qui subit un changement conformationnel lorsqu’il lie l’antagoniste de la progestérone,
• Le domaine d’activation de la transcription de la mifépristone à partir du facteur de transcription NFØB p65 (p65AD) pour activer la transcription à partir du promoteur silencieux GAL4-E1b

En l’absence de mifépristone, la conformation de la région hPR-LBD empêche la protéine régulatrice GeneSwitch™ d’activer la transcription à partir du promoteur GAL4-E1b. Lorsque la mifépristone est ajoutée et lie la région hPR-LBD, la protéine régulatrice GeneSwitch™ suppose une conformation qui permet de stimuler la transcription à partir du promoteur GAL4-E1b (Figures 1 et 2).

L’induction du système GeneSwitch™ conduit à l’activation du gène d’intérêt sur le vecteur pGene / V5-His. En outre, quatre sites de liaison Gal4 en amont du promoteur TK HSV minimal sur pSwitch peuvent lier la protéine régulatrice pSwitch. Par conséquent, l’ajout de mifépristone régule la production de protéines régulatrices (Figure 1). L’augmentation des niveaux de la protéine régulatrice GeneSwitch™ entraîne l’induction du gène d’intérêt de pGene / V5-His à des niveaux qui peuvent s’approcher de ceux des promoteurs viraux.

Le kit GeneSwitch™ offre des niveaux d’expression induits exceptionnellement faibles et élevés dans les cellules de mammifères. Le système fournit le vecteur d’expression pGene / V5-His avec un promoteur GAL4-E1b synthétique minimal qui est transcriptionnellement silencieux jusqu’à ce qu’il soit activé. La protéine régulatrice GeneSwitch™ lie le promoteur GAL4-E1b pour activer la transcription lors de l’ajout de la mifépristone. En outre, la protéine GeneSwitch™ régule sa propre expression, ce qui conduit à l’expression amplifiée du gène d’intérêt de pGene / V5-His. pGene / V5-His offre plusieurs caractéristiques qui facilitent l’analyse de l’expression et la purification des protéines recombinantes dans les cellules de mammifères :

• Marqueur d’épitope V5 d’extrémité C-terminale pour une détection avec un anticorps anti-V5
• Marqueur de polyhistidine d’extrémité C-terminale (6xHis) pour la purification rapide à l’aide de résine de chélation de nickel et la détection à l’aide d’anticorps anti-His(C-term)
•Le gène de résistance à la Zeocin™ pour une sélection efficace dans les cellules de mammifères et E. coli