TA Cloning™ Kit, Dual Promoter, with pCR™II Vector, without competent cells
TA Cloning™ Kit, Dual Promoter, with pCR™II Vector, without competent cells
Invitrogen™

TA Cloning™ Kit, Dual Promoter, with pCR™II Vector, without competent cells

Le kit TA Cloning™ Dual Promoter, combiné au vecteur pCR™ II, offre une stratégie de clonage rapide et en uneAfficher plus
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Référence K207040
Prix (EUR)
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Le kit TA Cloning™ Dual Promoter, combiné au vecteur pCR™ II, offre une stratégie de clonage rapide et en une seule étape, permettant d’insérer directement un produit PCR amplifié par Taq dans un vecteur plasmidique. Les promoteurs T7 et Sp6 du vecteur pCR™ II permettent une transcription in vitro de l’insert en vue de générer des produits de type sens et antisens. Le kit TA Cloning Dual Promoter s’appuie sur le vecteur de clonage pCR™ II et la ligase d’ADN ExpressLink™ T4 de façon à générer, à température ambiante et en quinze minutes, un produit de ligature. Les réactions permettent généralement d’obtenir >80 % de produits recombinants comportant des inserts.

Caractéristiques du double promoteur du kit TA Cloning™ Kit Dual Promoter :
Rapide et pratique—ligature à température ambiante en 15 minutes
Efficace—sélection bleue/blanche et >80 % de clones avec insert correct
Flexible—résistance à la kanamycine ou à l’ampicilline, offrant ainsi le choix de l’antibiotique souhaité
Sans tracas—élimination de toute modification enzymatique des produits de PCR
Simplification—aucune amorce pour PCR contenant des sites de restriction nécessaire

Caractéristiques du vecteur pCR™II :
• Saillies 3’-T pour la ligature directe de produits PCR amplifiés par Taq
• Accélérateurs de T7 et Sp6 pour la transcription et le séquençage in vitro de l’ARN
• Lieur multisite polyvalent avec sites EcoR I de flanquement pour faciliter l’excision des inserts
• Sites d’amorce M13 directs et inversés pour le séquençage

Fonctionnement du TA Cloning™
L’activité dissociée de tout modèle de la polymérase Taq confère une désoxyadénosine (A) unique aux extrémités 3’ des produits de PCR. Le vecteur linéarisé fourni dans ce kit comporte des résidus de déoxythymidine 3’ (T) simple. Ceci permet aux inserts de PCR de se ligaturer de façon efficace avec le vecteur.

Configurations du kit
Le kit TA Cloning™ est proposé dans différentes configurations : avec des cellules chimiquement compétentes INVF’ E. coli One Shot™ (K2050-01 et K2050-40), avec des cellules chimiquement compétentes TOP10F’ E. coli One Shot™ (K2060-01 et K2060-40), et sans cellules chimiquement compétentes (K2750-20 et K2750-40), dans des configurations à 20 ou 40 réactions.
Usage exclusivement réservé à la recherche. Ne pas utiliser pour des procédures de diagnostic.
Spécifications
Souche bactérienne ou de levuresNon inclus
Méthode de clonageTA Cloning
À utiliser avec (application)Clonage PCR
Nbre de réactions40 réactions
Gamme de produitsTA Cloning
Type de produitKit de clonage
AccélérateurT7, SP6
Quantité40 rxns
VecteurpCRII
FormatKit
Unit SizeEach
Contenu et stockage
Ce kit contient un vecteur pCR™II linéarisé, une ligase d’ADN ExpressLink™ T4, 5 tampons de ligature d’ADN ExpressLink™ T4, des dNTP, 10 tampons PCR, de l’eau stérile et des témoins.

Conserver tous les composants à -20°C. La stabilité de tous les réactifs est garantie pendant 6 mois, sous réserve d’une bonne conservation.

Foire aux questions (FAQ)

How do you recommend that I prepare my DNA for successful electroporation of E. coli?

For best results, DNA used in electroporation must have a very low ionic strength and a high resistance. A high-salt DNA sample may be purified by either ethanol precipitation or dialysis.

The following suggested protocols are for ligation reactions of 20ul. The volumes may be adjusted to suit the amount being prepared.

Purifying DNA by Precipitation: Add 5 to 10 ug of tRNA to a 20ul ligation reaction. Adjust the solution to 2.5 M in ammonium acetate using a 7.5 M ammonium acetate stock solution. Mix well. Add two volumes of 100 % ethanol. Centrifuge at 12,000 x g for 15 min at 4C. Remove the supernatant with a micropipet. Wash the pellet with 60ul of 70% ethanol. Centrifuge at 12,000 x g for 15 min at room temperature. Remove the supernatant with a micropipet. Air dry the pellet. Resuspend the DNA in 0.5X TE buffer [5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA (pH 7.5)] to a concentration of 10 ng/ul of DNA. Use 1 ul per transformation of 20 ul of cell suspension.

Purifying DNA by Microdialysis: Float a Millipore filter, type VS 0.025 um, on a pool of 0.5X TE buffer (or 10% glycerol) in a small plastic container. Place 20ul of the DNA solution as a drop on top of the filter. Incubate at room temperature for several hours. Withdraw the DNA drop from the filter and place it in a polypropylene microcentrifuge tube. Use 1ul of this DNA for each electrotransformation reaction.

Have you compared in vitro transcription levels between SP6 and T7 promoters in your pCRII vectors?

No, we have not done in-house comparisons of transcription levels. It is widely known though that T7 polymerase produces more RNA than SP6 (on the order of 10-fold higher).

When should DMSO, formamide, glycerol and other cosolvents be used in PCR?

Cosolvents may be used when there is a failure of amplification, either because the template contains stable hairpin-loops or the region of amplification is GC-rich. Keep in mind that all of these cosolvents have the effect of lowering enzyme activity, which will decrease amplification yield. For more information see P Landre et al (1995). The use of co-solvents to enhance amplification by the polymerase chain reaction. In: PCR Strategies, edited by MA Innis, DH Gelfand, JJ Sninsky. Academic Press, San Diego, CA, pp. 3-16.

Additionally, when amplifying very long PCR fragments (greater than 5 kb) the use of cosolvents is often recommended to help compensate for the increased melting temperature of these fragments.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our PCR and cDNA Synthesis Support Center.