BLOCK-iT™ lentivirales Pol II miR RNAi-Expressionssystem mit EmGFP

Das BLOCK-iT™ lentivirale Pol II miR RNAi-Expressionssystem kombiniert Invitrogen BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi- und ViraPower™ lentivirale Technologie, um die Erzeugung eines replikationsunfähigen Lentivirus zu erleichtern, das eine microRNA-(miRNA)-Sequenz von Interesse an teilende und nicht teilende Säugetierzellen für RNA-Interferenzanalysen (RNAi) liefert und damit die Möglichkeiten der RNAi-Anwendungen über die anderer herkömmlicher retroviraler Systeme hinaus zu erweitern (Naldini, 1998). Das BLOCK-iT™ lentivirale Pol II miR RNAi-Expressionssystem mit EmGFP enthält: o Ein BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi-Expressionsvektorkit für die Herstellung eines Expressionsklons, der ein doppelsträngiges Oligonukleotid enthält, das eine pre-miRNA-Sequenz zur Expression in Säugetierzellen kodiert. Der BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi-Expressionsvektor (pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR) bietet eine schnelle und effiziente Möglichkeit zur Klonierung von Oligoduplexen, die eine gewünschte miRNA-Zielsequenz in einen Vektor mit einem Pol-II-Promotor (CMV) zur Verwendung in der RNAi-Analyse codieren. Der BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi-Expressionsvektor wurde speziell für die Expression von miRNA-Sequenzen entwickelt und enthält spezifische miR flankierende Sequenzen, die eine ordnungsgemäße Verarbeitung von miRNA ermöglichen. o Co-cistronische Expression eines Emerald GFP (EmGFP) Reporters im pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR Vektor führt zu einer sehr starken Korrelation der EmGFP-Expression mit der Knockdown-Aktivität Ihrer miRNA o Der pDONR™221 Vektor zum Transfer der pre-miRNA-Expressionskassette in das lentivirale Expressionsplasmid mit Gateway™ Technologie. Die Gateway™ Technologie ist eine universelle Klonierungsmethode, die die seitenspezifischen Rekombinationseigenschaften der Bakteriophage Lambda (Landy, 1989) nutzt, um eine schnelle und hocheffiziente Methode zum Transfer Ihrer DNA-Sequenz von Interesse in mehrere Vektorsysteme zu bieten. o Ein pLenti6/V5-DEST-Zielvektor, in den die pre-miRNA-Kassette aus dem Expressionsklon mithilfe der Gateway™ Technologie transferiert wird. Dieses Expressionsplasmid enthält Elemente, die das Verpacken des Konstrukts in Virionen und des Blasticidin-Resistenzmarkers zur Auswahl der stabil transduzierten Zelllinien ermöglichen. o Gateway™ BP und LR Clonase™ II Enzymgemische, die den Transfer der pre-miRNA-Expressionskassette vom Expressionsvektor in den pLenti6/V5-DEST-Zielvektor erleichtern. o Komponenten des ViraPower™ lentiviralen Systems zur Erzeugung eines replikationsunfähigen Lentivirus, das die miRNA von Interesse sowohl in teilenden als auch nicht teilenden Säugetierzellen stabil exprimiert. Die ViraPower™ lentivirale Technologie ermöglicht die hocheffiziente In-vitro- oder In-vivo-Abgabe eines Zielgens oder einer RNA an teilende und nicht teilende Säugetierzellen mit einem replikationsunfähigen Lentivirus. Basierend auf dem LentiKat™ System, das von Cell Genesys (Dull et al., 1998) entwickelt wurde, verfügt die ViraPower™ lentivirale Technologie über Merkmale, die ihre Biosicherheit verbessern und gleichzeitig eine hohe Expression in einem breiteren Spektrum von Zelltypen ermöglichen als herkömmliche retrovirale Systeme.