Active Arf1 Pull-Down and Detection Kit

El kit de «pull-down» y detección de Arf1 activo Thermo Scientific Pierce es un kit completo para el enriquecimiento selectivo y la detección de Arf1 GTPasa unida a GTP a través de una interacción específica de proteínas con el dominio de unión de proteínas de GGA3.

El kit de «pull-down» y detección de Arf1 activo incluye dominio de unión de proteínas (PBD) GST-GGA3 purificado, resina de glutatión agarosa, controles positivos y negativos (GTPγS y GDP, respectivamente), tampón de lisis/unión/lavado, anticuerpo primario anti-Arf1, tampón de muestra, columnas de centrifugado y tubos de recogida. El kit fue validado usando lisados de células MDCK, una línea celular que es conocida por tener una fuerte actividad Arf1.

Características del kit de detección y «pull-down» de Arf1 activo:

• Gran sensibilidad y precisión: los reactivos optimizados, el anticuerpo anti-Arf1 específico y el procedimiento Western blot garantizan unos controles precisos y resultados semicuantitativos
• Validado: funcionalmente probado para la detección de Arf1 para garantizar la calidad y el rendimiento
• Compatible: eficaz con una variedad de tipos de células de ratón, rata y fuentes humanas

Aplicaciones:
• Seguimiento de la activación de Arf1 GTPasa durante la diferenciación celular, la migración, la división y la reordenación citoesquelética
• Estudio de la activación de Arf1 durante el montaje de proteínas de revestimiento en vesículas en brote o en la red del trans Golgi y endosomas
• Supervisión de la actividad de Arf1 después de la estimulación con factores de crecimiento
• Supervisión de la actividad de Arf1 después del tratamiento inhibidor de moléculas pequeñas

El kit activo de «pull-down» y detección de Arf1 se validó para la función y especificidad del método de enriquecimiento Arf1 activo utilizando lisados celulares tratados con GTPγS para activar el Arf1 endógeno y se comparó con lisados tratados con GDP para inactivar la pequeña GTPasa. El tratamiento con GTPγS atrapa Arf1 en la forma ligada al GTP (activo), dando como resultado una señal fuerte cuando está presente el Arf1 endógeno. El tratamiento del GDP empuja a Arf1 a un estado de unión (inactivo) al GDP, dando como resultado una señal mínima o nula, independientemente de los niveles de proteína Arf1. El kit está optimizado para la detección de Western blot usando un anticuerpo secundario conjugado con HRP (IgG de cabra anticonejo, n.° de pieza 31460) y el sustrato quimioluminiscente Thermo Scientific SuperSignal West Pico (n.° de pieza 34080). El kit contiene suficientes componentes para 30 ensayos de «pull-down».

Fondo Arf1:
Las proteínas del factor de ribosilación ADP 1-6 (Arf) son miembros de la familia Ras de GTPasa pequeñas. Aunque estructuralmente son similares, los roles celulares de Arf1-6 son diferentes de los roles de otros miembros de la familia Arf; sus roles endógenos no son la ribosilación ADP, sino la regulación de las proteínas G heterotriméricas. Las proteínas Arf se pueden dividir en tres clases: Clase I—Arf 1 a 3; clase II—Arf 4 y 5; clase III—Arf6. Las Arf de clase I y II están asociados con la red del trans Golgi (TGN) y participan en el reclutamiento de proteínas efectoras en la membrana Golgi y en la formación de vesículas. A diferencia de otras GTPasa, las Arf GTPasa se modifican por miristoilación en el aminoterminal para permitir la inserción en la membrana. La proteína de clase III Arf6 está asociada a la membrana plasmática y está implicada en la formación de vesículas en la membrana plasmática, el reciclaje de vesículas y la remodelación del citoesqueleto de actina.

Aunque las Arf GTPasa se expresan en todas las células, Arf1 es la más abundante, activa y mejor caracterizada. Arf1 recluta sus efectores, incluyendo el complejo adaptador de coatómero y clatrina (AP), al Golgi para la formación y el brote de vesículas. Después de reclutarlos, Arf1 mantiene las proteínas de revestimiento en la membrana hasta que se forma la vesícula. Arf1 entonces interactúa con su efector que da como resultado la liberación de Arf1 de la membrana y el brote de la vesícula. Las proteínas de unión del efector Arf (GGA) que contienen γ-ear localizadas en Golgi contienen un dominio VHS aminoterminal, un dominio de homología GGA (GGAH), una región enlazadora rica en prolina y un dominio de homología de adaptación de γ-ear carboxi-terminal (AGEH). El dominio VHS interactúa con dominios citoplasmáticos para la clasificación de receptores, el dominio GGAH se une a Arf activado, la región rica en prolina interactúa con la clatrina y el dominio AGEH interactúa con proteínas citosólicas. A través de estudios mutacionales, se ha demostrado que el dominio GGAH es suficiente para unir Arf unido a GTP, y que Arf1 une las tres proteínas efectoras de GGA. La asociación de las proteínas GGA con el TGN y con la membrana plasmática está regulada por el Arf.

Más datos de producto
• Medir la activación de las GTPasas pequeñas a través de sus efectores posteriores específicos