DTNB (reactivo de Ellman) (ácido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzoico)

El reactivo de Ellman (DTNB) Thermo Scientific Pierce reacciona con grupos sulfhidrilo para producir un producto coloreado que proporciona un método fiable para medir cisteínas reducidas y otros sulfhidrilos libres en solución.

El reactivo de Ellman (5,5'-ditio-bis-[ácido 2-nitrobenzoico]) se utiliza para estimar los grupos de sulfhidrilo en una muestra comparándolo con una curva estándar de un compuesto que contiene sulfhidrilo, como la cisteína. Alternativamente, los grupos de sulfhidrilo se pueden analizar usando el coeficiente de extinción de TNB (14.150 m-1 cm-1 a 412 nm). El reactivo de Ellman se ha utilizado para aplicaciones distintas a la estimación de sulfhidrilo, como la determinación de alquiltioles por HPLC mediante un procedimiento de derivatización precolumna y para estudiar tioles en el sitio activo de varias enzimas.

Características del reactivo de Ellman:

• Ensayo de sulfhidrilo: reacciona cuantitativamente con grupos libres (reducidos) de sulfhidrilo (SH) para crear un producto TNB detectable
• Detección colorimétrica: el producto coloreado permite la medición espectrofotométrica en cubetas o microplacas (λmáx = 412 nm; ε = 14.150/m·cm)
• Método probado: los compuestos químicos bien caracterizados proporcionan la cuantificación de grupos sulfhidrilo de péptidos o proteínas mediante el cálculo del coeficiente de extinción o la comparación con un estándar de cisteína

Propiedades del reactivo
• Nombres alternativos: DTNB, reactivo de Ellman
• Nombre químico: 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitrobenzoico)
• Reactivo a: grupos de sulfhidrilos (—SH)
• Fórmula química: C₁₄H₈N₂O₈S₂
• Número CAS: 69-78-3
• Peso molecular: 396,35
• Forma: Polvo cristalino amarillo

El DTNB reacciona con un grupo libre de sulfhidrilo para producir un disulfuro mixto y ácido 2-nitro-5-tiobenzoico (TNB). El objetivo del DTNB en esta reacción es la base conjugada (R—S-) de un grupo sin sulfhidrilo. Por lo tanto, la velocidad de esta reacción depende de varios factores: (1) el pH de la reacción, (2) la pKa' del sulfhidrilo y (3) efectos estéricos y electrostáticos. TNB es la especie coloreada producida en esta reacción y tiene un alto coeficiente de extinción molar en el intervalo visible. Ellman (1959) informó originalmente que el coeficiente de extinción molar de TNB era de 13.600 m-1 cm-1 a 412 nm y pH 8,0. En consecuencia, este valor se ha citado con frecuencia en la literatura. Estudios posteriores han demostrado, sin embargo, que el coeficiente de extinción molar se refleja con mayor precisión por un valor de 14.150 m-1 cm-1 a 412 nm. La extinción del TNB no se ve afectada por cambios en el pH entre 7,6 y 8,6. Sin embargo, la extinción de TNB es diferente en otros disolventes.