TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit

El kit Cells-to-C_T PreAmp TaqMan Ambion™ permite realizar análisis de expresión directamente de las células cultivadas sin necesidad de purificar el ARN. El protocolo incluye un paso de amplificación intermedio (pre-amplificación) entre la transcripción inversa y la PCR en tiempo real en la que el ADNc se enriquece para hasta 100 objetivos genéticos del uso rs elección sin sesgo de amplificación.

• Solución completa y validada: el flujo de trabajo optimizado incluye reactivos de lisis celular, ADNasa, reactivos RT, reactivos de PreAmp y mezcla maestra de expresión génica TaqMan™
• Preparación rápida, sencilla y cómoda: prepare muestras en 7 minutos; eliminación del tedioso aislamiento de ARN
• Amplíe las muestras limitadas: aumentan el potencial de PCR en tiempo real hasta 64 veces; estudie hasta 100 genes a la vez
• Resultados precisos: amplificación uniforme sin introducir sesgo
• Rendimiento sólido: detección lineal de 10 a 100.000 células; resultados equivalentes al ARN purificado

Solución completa y validada

Gracias a un método único para lisiar células cultivadas al tiempo que elimina el ADN genómico y conserva la integridad del ARN, el kit Cells-to-C _T™ PreAmp TaqMan™ contiene reactivos de transcripción inversa (RT) para la síntesis de ADNc, la mezcla maestra de preamplificador TaqMan™ para la preamplificación de hasta 100 objetivos genéticos y la mezcla maestra de expresión génica TaqMan™ para el análisis de PCR en tiempo real.

Preparación de muestras sencilla y cómoda en 7 minutos

El kit Cells-to-C_T™ PreAmp TaqMan™ incorpora un procedimiento de preparación de muestras sencillo de 7 minutos (figura 1) para su uso con 10 a 100.000 muestras de células cultivadas. Las células se lavan en PBS y se lisan en la solución durante 5 minutos a temperatura ambiente; el tratamiento de ADNasa se puede realizar simultáneamente. Para finalizar la lisis, las células se deben someter a un proceso de incubación de 2 minutos con solución de parada a temperatura ambiente.

Los lisados ya están listos para la transcripción inversa o el almacenamiento a –20 °C. Puesto que las muestras se pueden procesar directamente en placas de cultivo (96 o 384 pocillos), se minimiza la manipulación de muestras y la posibilidad de que se pierdan o se produzcan errores de transferencia, lo que facilita la ampliación de muestras limitadas. No es necesario calentar, lavar ni centrifugar; el kit simplifica en gran medida un proceso tradicionalmente largo y laborioso y lo reduce a 7 minutos.

Ampliación de muestras limitadas: aumenta el potencial de PCR en tiempo real hasta 64 veces

La integración de la tecnología Cells-to-C_T™ con capacidad de preamplificación agiliza el flujo de trabajo de varios pasos a la vez que amplía (más de 60 veces) el número de reacciones de PCR posibles a partir de muestras valiosas, y aumenta la sensibilidad de la detección de ARNm a partir de pequeñas cantidades de muestras.

La reacción estándar de PCR en tiempo real para el análisis de la expresión génica comienza con la transcripción inversa del ARN total al ADNc mediante cebadores aleatorios y oligo dT, seguida de una PCR en tiempo real mediante sondas y cebadores específicos de genes (figura 2). Con el kit Cells-to-C _T™ PreAmp TaqMan™, se realiza un paso de amplificación intermedio (pre-amplificación) entre la transcripción inversa y la PCR en tiempo real en el que el ADNc se enriquece para hasta 100 objetivos genéticos de la elección del usuario sin sesgo de amplificación. La reacción preamplificada resultante se diluye y sirve como material de partida para los ensayos individuales posteriores de expresión génica TaqMan™ utilizando la mezcla maestra de expresión génica TaqMan™ incluida en el kit. El proceso PreAmp TaqMan™ amplía de forma eficaz las muestras hasta 64 veces, lo que permite realizar análisis que antes no eran posibles a partir de materiales de muestra limitados.

Resultados precisos: amplificación homogénea sin introducir sesgo

La capacidad de realizar una pre-amplificación fiable y uniforme es fundamental para el análisis de la expresión génica a partir de muestras limitadas. Mientras que otros métodos están disponibles para preamplificar ARN o ADNc, utilizan cebado no específico para amplificar el material inicial, lo que se traduce en una amplificación sesgada e inexacta de algunas transcripciones sobre otras. La mezcla maestra TaqMan™ PreAmp, que forma parte del kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™, utiliza cebadores específicos de genes para preamplificar el ADNc, lo que se traduce en una amplificación no sesgada. El kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ demuestra una preamplificación imparcial equivalente al ARN purificado en comparación con 100 ensayos de expresión génica TaqMan diferentes. Como se muestra en la figura 3, la reacción de preamplificación no introduce sesgo de lisados de Cells-to-C_T™ ni muestras purificadas; ≥92 % de los ensayos estaban dentro de +⁄- 1,5 ΔΔ CT para ADNc preamplificado frente a ADNc no amplificado, ya sea de ARN purificado (A) o de lisados del kit Cells-to-C_T™ (B).

Rendimiento sólido: resultados equivalentes al rendimiento
de ARN purificado del kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ El kit se evaluó con 100 ensayos TaqMan™ diferentes utilizando lisados Cells-to-C_T™ o ARN purificado, con o sin preamplificación. Como se muestra en la figura 4, los valores de CT obtenidos con los lisados del kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ fueron equivalentes a y con frecuencia mejores que los valores de CT obtenidos con ARN purificado, antes de (A) o después de la preamplificación (B). El alto nivel de rendimiento de los lisados del kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ puede atribuirse a la conservación del ARN en las muestras iniciales sin pérdida debido al calentamiento, transferencia o adsorción a matrices.

Detección lineal de 10 a 100 000 células

Cada paso de un flujo de trabajo para la creación de perfiles de ARN debe ser sólido para trabajar desde unas pocas o muchas células. El kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ se ha optimizado para generar linealidad de forma eficaz en 5 registros de entrada celular, a partir de 10-100 000 células por reacción de lisis (figura 5). Además, para maximizar la sensibilidad, el kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ permite que hasta el 45 % del volumen de reacción RT se componga de lisado de muestras. El kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ proporciona una sensibilidad máxima derivada del gran volumen de lisado utilizado en la reacción RT, las condiciones de reacción RT optimizadas y la preamplificación de muestras antes de la PCR en tiempo real.

Rendimiento probado, probado conjuntamente

Todos los componentes del kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ se han optimizado para un rendimiento uniforme y fiable. Esto elimina las conjeturas asociadas con la preparación de muestras separadas, la RT, la preamplificación y los kits de PCR en tiempo real. Para una mayor garantía de calidad, el kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ se ha validado con ensayos de expresión génica TaqMan™.