Exonucleasa del gen 6 T7

La exonucleasa del gen 6 T7 hidroliza el ADN bicatenario de forma no procesable en la dirección 5'→3 'de los nucleótidos 5'-fosforilo o 5'-hidroxilo liberando oligonucleótidos y mononucleótidos, hasta que aproximadamente el 50 % del ADN es soluble en ácido. También degrada los nucleótidos en las brechas y cortes del ADN bicatenario del extremo 5' y el ARN de los híbridos ARN:ADN en la dirección 5'→3'.

La exonucleasa del gen 6 T7 es similar a la exonucleasa lambda, ya que cataliza la hidrólisis gradual del ADN bicatenario a partir de los mononucleótidos 5' de liberación del extremo 5'. Sin embargo, a diferencia de la exonucleasa lambda, la enzima tiene baja capacidad de procesamiento y eliminará tanto el extremo 5'-hidroxilo como el 5'-fosforil.

También degrada el ARN y el ADN de los híbridos ARN:ADN en la dirección 5'→3' pero no puede degradar el ARN bicatenario o monocatenario.

Esta enzima se ha utilizado para generar plantillas de ADN monocatenarias para secuenciación o análisis SNP.

Propiedades
Peso molecular: 32 kDa
pH óptimo: 7,5
Temperatura óptima: 37 °C
Inactivación: 75 °C durante 10 min o añada 2 µl de 0,5 M de EDTA para un volumen de reacción de 50 µl.

Inactivación
Calentamiento a 75 °C durante 10 min o añadiendo 2 µl de 0,5 M de EDTA para un volumen de reacción de 50 µl.

Pureza
Superior al 95 % pura según lo determinado por SDS-PAGE. Probada para endonucleasas contaminantes y ribonucleasas.

Tampón de almacenamiento
50 mM de KPO₄ (pH 6,5), 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 50 % de glicerol.

Condiciones del ensayo
La mezcla de reacción (50 µl) contiene 50 mM de Tris-HCI (pH 8,1), 5 mM de MgCl₂, 20 mM de KCI, 5 mM de 2-mercaptoetanol, ADN bicatenario y enzima. La incubación se produce a 37 °C durante 15 min

Definición de la unidad
Una unidad es la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 nmol de nucleótido soluble en ácido en 15 min a 37 °C en condiciones de ensayo estándar.

Concentración
50 unidades/µl

Fuente
La cepa E. coli contiene un clon sobreproductor de la exonucleasa del gen 6 T7

Test funcional
Conversión de 0,5 pmol de λ ADN a media molécula monocatenario por 75 unidades de enzima en 30 min a 37 °C. Verificación por electroforesis en gel de agarosa.

Aplicaciones:
  1. Digestión escalonada controlada de ADN bicatenario desde extremo 5'
  2. Generación de plantillas de ADNss para secuenciación o análisis de SNP